6 第五节 诊断用制品制造技术

第四章第五节诊断用生物制品制造技术诊断用生物制品（diagnosticum）包括诊断用抗原、诊断用抗体（血清）和标记抗体等三类。该类制剂的最基本要求是特异性强和敏感度高。生物制剂用于诊断的原理(略)诊断液:利用细菌、病毒和寄生虫培养物、代谢物、组分（提取物）和反应物等有效物及动物血清等材料制成的，专门用于动物传染病和寄生虫病诊断和检疫的一大类制品。一、诊断抗原（一）血清学诊断抗原血清学诊断抗原是用已知微生物和寄生虫、微生物和寄生虫的组分或浸出物、代谢产物、感染动物组织制成，用以检测血清中的相应抗体该类制剂可与血清中的相应抗体发生特异性反应，形成可见或可以测知的复合物，以确诊动物是否受微生物感染或接触过某种抗原。常用的抗原有凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原和酶联免疫吸附试验（ELISA）抗原等。1、凝集反应抗原凝集反应抗原是颗粒性抗原，如细菌和红细胞等。在有电解质存在条件下，能与特异性抗体结合，形成肉眼可见的凝集现象。举例:布鲁氏菌凝集反应抗原、马流产凝集反应抗原、鸡白痢全血凝集反应抗原、猪传染性萎缩性鼻炎I相菌抗原和鸡源支原体平板凝集反应抗原等。布鲁氏菌凝集反应抗原制造及使用方法①菌种抗原性良好的2～3种布鲁氏菌。菌落须为光滑型。②制造要点将检定合格的种子液，接种于适于布鲁氏菌生长的琼脂扁瓶上(或液体通气培养基)，37℃培养2～3d；加入适量0.5％石炭酸生理盐水，洗下培养物，经纱布过滤，涂片杂菌检查。热凝集和吖啶黄凝集试验合格的过滤菌液，在70～80℃水浴中杀菌lh，观察无凝集块出现，离心,将下沉菌体重新悬浮于0.5％石炭酸生理盐水中，此即为浓菌液，置2～10℃冰箱中保存备用。③标化用石炭酸生理盐水将浓菌液稀释为1:20、1:24、1:28、1:32、1:36，5个不同稀释度，将标准阳性血清稀释为1:300、1:400、1:500、1:600、1:700，5个稀释度。将稀释的抗原和血清排成方阵进行试管凝集试验，每只反应管中加抗原和血清各0.5ml，37℃24h观察结果。观察/测定当标准阳性血清对标准抗原的凝集价为1:1000“++”时，在血清1:1000稀释度呈现“++”，1:1200呈现“-”，“±”或“+”的凝集现象的抗原最小稀释度，即为浓菌液应稀释的倍数。在下表中(举例)浓菌液的稀释倍数为1:28，此即为标化抗原的初测结果。然后再以同法作一次测定，如果第二次结果仍为1:28倍，则此批浓菌液作1:28倍稀释，即为使用液。出厂的抗原原液比使用液浓20倍。菌液稀释血清最初稀释度1:3001:4001:5001:6001:700加入抗原后的血清稀释度1:6001:8001:10001:12001:14001:20++++++--1:24++++++--1:28+++++++++±-1:32++++++++++-1:36+++++++++++-标准抗原+++++++++--(1:20)④成品检验抗原应为乳白色均匀菌液，没有摇不散的凝块或杂质,没有任何细菌生长。对标准阳性血清1:1000倍稀释出现“++”凝集，对阴性血清1:25～1:200稀释均不出现凝集。2、沉淀反应抗原沉淀反应抗原为胶体状态的可溶性抗原，如细菌和寄生虫的浸出液、培养滤液、组织浸出液、动物血清和动物蛋白等，与相应抗体相遇，在二者比例合适并有电解质存在时，抗原抗体相互交联形成免疫复合物达一定大时，即出现肉眼可见的沉淀。沉淀抗原是细胞浸出成分，为细微的胶体溶液，单个抗原的体积小而总面积大，出现反应需要的抗体量多，故试验时常采取稀释抗原加不稀释的血清，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。沉淀反应抗原分类由于使用方法不同，沉淀反应抗原又分为环状反应抗原，如炭疽动物脏器抗原；絮状反应抗原，如测定抗毒素效价的絮状反应抗原；琼脂扩散反应抗原和免疫电泳抗原等。我国用于畜禽沉淀反应抗原有马传染性贫血琼脂扩散反应(AGP)抗原、鸡传染性法氏囊病AGP抗原、及马立克氏病（MD）AGP抗原等多种。马立克氏病（MD）AGP抗原用11～13日龄的鸭胚制备成纤维细胞单层培养物，24h后接种MD病毒感染鸡的脾细胞悬液。接种后24h，吸出接种物并更换营养液，接毒后约6d，消化细胞，分瓶，传3代后，细胞培养物即可用于制备MD沉淀抗原。一般在75%以上的细胞出现病变时进行收获，在-20℃以下冻结，室温融化，如此反复冻融3次，经适当浓缩后即为抗原。用双扩散法进行诊断。3、补体结合反应（CF）抗原补体结合反应包括反应系统（检测系统）和指示系统（溶血系统）。反应系统为抗原和抗体。指示系统是绵羊红细胞及溶血素。补体可与反应系统的抗原-抗体复合物结合，也可与绵羊红细胞-溶血素的复合物结合而引起溶血，以观察溶血与否来判定反应的结果。在补体的参与下可明显地提高抗原、抗体特异性反应的敏感性。我国生产的兽用补体结合反应抗原有马传染性CF抗原、鼻疽CF抗原、布鲁氏菌CF抗原和钩端螺旋体CF抗原等。鼻疽补体结合反应抗原的制造及检验程序①菌种用1～3株抗原性良好的鼻疽杆菌，接种在4%甘油琼脂培养基上，37℃培养2d，经检定合格者后用生理盐水洗下，作为种子培养物。②制造要点将种子培养物均匀地接种于甘油琼脂扁瓶，37℃培养3～4d，挑选生长典型和无杂菌污染者，用灭菌含0.5%石碳酸生理盐水洗下培养物，121℃灭菌30min，置于2～15℃冷暗处浸泡2～4个月，吸取上清液即为抗原，按常规方法进行无菌检验。③效价测定将抗原用生理盐水作1:10、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:300、1:400和1:500稀释。用生理盐水将两份鼻疽阳性血清分别稀释成1：10，1:25、1:50、1:75和1:100，在58～59℃水浴灭活30min，按表4.5、4.6和4.7测定抗原效价。对两份阳性血清的各种稀释液均发生最强的抑制溶血现象的抗原稀释度，即为抗原效价。在本例中，抗原效价为1:150。制成的抗原效价在1:100以上认为可用。测定抗原效价后，取一份阴性马血清作1:5和1:10稀释，在58～59℃灭活30min，然后与新制抗原的一个工作量作补体结合反应，必须为阴性，方认为合格。（二）变态反应抗原细胞内寄生菌(如鼻疽杆菌，结核分支杆菌和布鲁氏菌等)，在传染过程中引起以细胞免疫为主的第IV型变态反应，即感染机体再次遇到同种病原菌或其代谢产物时出现一种具有高度特异性和敏感性的异常反应。据此,临床上常用于诊断某些传染病。引起变态反应的抗原物质称为变应原（变态反应抗原），如鼻疽菌素、结核菌素和布鲁氏菌水解素等。布鲁氏菌水解素是变态反应原性良好的布鲁氏菌水解物，专用于绵羊和山羊布鲁氏菌病的变态反应诊断。羊的皮肤变态反应在愈后1～1.5年才逐渐消失，所以对污染羊群检出率高于血清学方法检测结果。布鲁氏菌水解素制造方法1．菌种培养特性和生化性状典型、热凝集试验和吖啶黄凝集试验阴性、菌落为光滑型的布鲁氏菌，变态反应原性良好，对布鲁氏菌阳性血清具有高度的凝集性。2.制造要点将种子菌液接种于肝汤琼脂扁瓶培养基上37℃培养2～7d（或液体通气培养36h），用0.5%石炭酸生理盐水洗下生长良好的培养物，在70～80℃水浴中加热灭菌lh，离心沉淀去上清，菌体悬浮于0.5%石炭酸生理盐水中，再离心沉淀洗一次。菌体悬浮于0.5%硫酸水溶液中，使悬液浓度大致为布鲁氏菌试管凝集抗原液的2倍，盛于玻璃瓶中，121℃加热30～40min，促使菌体水解。制造要点室温或冰箱放置12～24h，吸取上清液，用NaOH液调整为pH6.8～7.0，再静置沉淀未水解部分。上清液用蔡氏滤器过滤后75～80℃加热，凯氏法测定总氮量（用标准水解素作对照），用灭菌蒸馏水稀释滤液，使其最终总氮量为0.4～0.5mg/ml（或与标准的水解素相同）。3．质量标准除按《成品检验的有关规定》进行外，须做如下检验：①安全检验：取体重18～22g小鼠6只，腹腔注射水解素0.5m1，观察10d，应全部健活。②效力检验：取体重350-500g豚鼠10只，皮下接种适量布鲁氏菌令其感染致敏，经30-40d，用标准水解素1:10稀释液0.1ml接种于臀部皮内，经24h和48h观察反应面积在100mm以上，即可用作正式试验。正式试验然后剃去合格豚鼠腹部两侧的被毛，被检水解素和标准水解素分别作5和10倍稀释，一侧腹部皮内注射0.1ml被检水解素，另侧注射同量的标准水解素，同时用两只未致敏的健康豚鼠，依前述方法和剂量注射被检水解素，和标准水解素作为对照，经24h和48h各观察一次，被检水解素肿胀面积的总和应与标准水解素肿胀面积的总和一致，或比值不超过0.1,对照豚鼠无反应为合格。二、诊断抗体诊断抗体包括诊断血清和单克隆抗体等。诊断血清简称抗血清（antiserum），是指利用血清反应以鉴别微生物、鉴定病原血清型或诊断传染病的一种含已知的特异性抗体的血清。通常以抗原免疫接种动物制成。有些血清则需再经吸收除去非特异性抗体成分后供诊断用。分类和定义含有多种血清型抗体的血清称为多价诊断血清，只对一个型的称为单价诊断血清或称因子血清。单含鞭毛抗体成分的血清称为H血清，单含菌体成分的血清称为O血清。针对菌毛和针对荚膜的均称为K血清。血清中的抗体一般是由多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的，故称之为多克隆抗体（polyclonalantibody）。由一个B细胞克隆所分泌的抗体为单克隆抗体（monoclonalantibody）。三、标记抗体具有示踪效应的化学物质与抗体结合后，仍保持其示踪活性和与相应抗原特异结合能力，此种结合物称为标记抗体。可借以示踪和检测抗原的存在及其含量，多用于鉴定抗原和诊断疾病。常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素。（一）荧光素标记抗体技术将提纯的抗体球蛋白用冷pH7.2PBS稀释成10-20mg/ml的浓度，按蛋白量的1/80和1/100加入异硫氰酸荧光黄（FITC），先用pH9.50.5M碳酸盐缓冲液溶解FITC，于5min内滴加到抗体球蛋白溶液中，最后补加碳酸盐缓冲液，使其总量为抗体球蛋白溶液量的1/10；标记在4℃搅拌标记12～15h（20～25℃1～2h）：用大量的pH7.2PBS透析4h，用SephadexG-50凝胶滤除标记抗体中游离荧光素，通过DEAE纤维素层析除去过高标记和未标记的蛋白分子；最后测定效价和特异性，分装保存。标本染色分直接染色法和间接染色法（二）酶标记抗体技术常用方法有戊二醛一步法、戊二醛二步法和过碘酸钠氧化法三种。本文只介绍过碘酸钠氧化法。其原理是辣根过氧化物酶（HRP）含18%碳水化合物，过碘酸钠将酶分子表面的多糖链氧化为醛基，用硼氢化钠中和多余的过碘酸。酶上的醛基很活泼，可与蛋白质的氨基结合。标记步骤：①取5mgHRP溶于1.0ml新配制的0.3mo1pH8.2的NaHCO3，溶液中。②滴加0.1mll%2,4二硝基氟苯（FDNB）无水乙醇溶液，室温避光轻轻搅拌1h。③加入1.0m10.06M过碘酸钠（NaIO4）水溶液，室温轻搅30min。标记步骤：④加入lml0.16M乙二醇，室温避光轻搅，然后装人透析袋中。⑤于1000mlpH9.50.01M碳酸钠缓冲液中，4C透析过夜，其间换液3次。⑥吸出透析袋中液体，加入每毫升含IgG5mg的pH9.50.01M碳酸钠缓冲液1m1，室温避光轻轻搅拌2-3h。⑦加硼氢化钠（NaBH4）5mg，置4℃3h或过夜。标记步骤：⑧逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，置4℃1h后，4000r/min离心15min，弃上清，沉淀。再用50%饱和硫酸铵沉淀2次。⑨沉淀物溶于少量pH7.40.01M磷酸缓冲盐水液，装人透析袋，以同样缓冲盐水液充分透析至无铵离子，l0000rpm离心30min，上清液即为酶标记抗体。该类制剂主要用于ELISA试验。（三）放射性同位素标记抗体技术目前多使用同位素碘作标