测序质量判断和测序常见问题

测序质量判断和测序常见问题DNA测序原理•目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。Sanger法测序的原理•Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。•它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。自动化测序•首先，通过对ddNTP进行不同的荧光标记实现在一个泳道实现四种碱基判读。•后来，各公司有改进了电泳方法，将毛细管电泳技术引入了测序仪，大大提高了分辨率。（排除了横向扩散和泳道间的干扰）影响测序结果的因素测序反应反应组分模版引物其他标准试剂污染组分反应条件体积退火温度退火时间产物纯化样品纯度（空气，盐离子，染料，乙醇）电泳分离上样量电泳条件检测荧光激发和接受的灵敏度常见问题•反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上•序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插入”，有“缺失”•测序长度太短了常见问题的原因•反应整体差，杂峰很多，序列完全比不上–根本没反应，引物和模版不匹配•序列能比上，但很多地方有“突变”，有“插入”，有“缺失”，测序长度太短了–有反应，但质量差•分析一下原因可帮助大家却认测序结果，确定是否需要重新测序。•分析时应从大到小，从整体入手整体比对反应整体形状具体位置原因有强平均峰宽，峰形向前拖引物降解向后拖样品降解头大脚小反应前部较好但很短，看峰形是个“大头娃娃”引物过多信号突然衰减或消失Poly结构互补结构个别位置问题70-80，100-120有C或T峰染料峰200,400有G峰乙醇峰50bp之前信号杂乱，有高峰引物二聚体个别碱基不匹配前后反应信号良好突变反应过程中突然有高峰位置不定气泡弱模版量引物引发效率无有反应信号多模版多结合位点反应信号相当弱引物和模版不匹配哥们给你上了板水软件•SequenceScannerv1.0完了！