1.流式细胞仪基础知识介绍

©2011MindrayConfidential流式细胞仪的基础知识迈瑞公司谭伟峰15210608682©2011MindrayConfidential2目录流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪的结构和原理流式数据的获取和分析©2011MindrayConfidential3目录流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理流式细胞仪的结构和原理流式数据的获取和分析©2011MindrayConfidential4流式细胞仪的定义流式细胞术（flowcytometry,FCM）：是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。流式细胞仪(flowcytometer)：是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器。©2011MindrayConfidential5流式细胞仪的检测特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术光信号©2011MindrayConfidential6流式细胞仪的检测范围检测范围：凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测。RNA含量细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积DNA含量与细胞周期蛋白质含量钙离子，PH值,膜电位细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能©2011MindrayConfidential7流式细胞仪的分类分析型自动化程度高，操作简单，适用于临床使用；分选型分辨率高，多激光高配置，可将感兴趣的细胞分选出来，适用于科研使用；©2011MindrayConfidential8常见分析型流式细胞仪©2011MindrayConfidential9常见分选型流式细胞仪©2011MindrayConfidential10目录流式细胞仪的结构与原理流式样本的前处理流式细胞仪的定义和分类流式数据的获取和分析©2011MindrayConfidential11流式细胞仪的结构及原理液流系统液流驱动原理光学系统信号产生与收集原理电子系统信号检测原理©2011MindrayConfidential12液流系统主要作用：提供稳定的鞘流，将样本悬液聚焦在光束中心处以供检测；主要部件：流动室（对于分选型也叫喷嘴）、管路、阀门样本流实现方式：负压驱动样本流：BD：FACSVerse、AcurriC6，Mindray：BriCyteE6正压实现样本流：BD：FACSCantoⅡ、Calibur、Aria，BCI：FC500、Gallios©2011MindrayConfidential13液流驱动原理鞘液流动室样本鞘液样本流进样针流动室©2011MindrayConfidential14主要作用：提供光源、产生并收集光信号主要部件：激光器、透镜、滤光片光学系统FSCFocuslensFlowCellBeamstopFITCPEPercpAPCDM1DM2SSC488638491lp550lp645lp488/10488/10530/30585/40672lp740lpmirror660/20mirrormirrorPE-cy7APC-cy7780/60780/60BriCyteE6仪器的光学系统图©2011MindrayConfidential15激光器蓝光488nm红光638nm紫光405nm紫外光355nm绿光532nm（注：根据其激发波长区分）信号产生要素之一©2011MindrayConfidential16信号产生要素之二荧光素常见荧光素及其激发激光器©2011MindrayConfidential17信号产生要素之三荧光染色荧光素角色荧光标记荧光素荧光素抗体携带抗原的细胞©2011MindrayConfidential18信号产生原理©2011MindrayConfidential19滤光片长通滤片短通滤片带通滤片波长大于特定功能的光可以通过，波长小于该波长的光被反射波长小于特定功能的光可以通过，波长大于该波长的光被反射波长在某特定范围内的光可以通过，波长在该范围以外的光被反射480535580480535580530长通530短通530/30带通480535580信号收集原理-滤光片©2011MindrayConfidential20主要作用：接收、处理光信号；将光信号转变为电信号，再将电信号数字化；主要部件：光电二极管（PD)、光电倍增管（PMT）、信号处理板电子系统©2011MindrayConfidential21信号检测原理信号检测器•光电二极管无电流放大作用信噪低•光电倍增管（PMT）电流放大倍数可达106信噪比较光电二极管高tv脉冲高度（H）脉冲宽度（W）脉冲面积（A）©2011MindrayConfidential22信号类型脉冲信号荧光侧向散射光前向散射光FSC检测器FSC检测器激光SSC检测器SSC检测器©2011MindrayConfidential23FL4FL6FL5(PE-cy7)FL3(PerCP)FL2(PE)FL1(FITC)SS488/10530/30FS488/10585/40670LP785/60491/LP550LP645LP660/20785/60740LP反光镜tvFL6(APC-cy7)FL4(APC)反光镜tvtvtvtvtvtvtvFSCSSCFL1FL2FL3FL5流式细胞仪工作原理模拟图©2011MindrayConfidential24配置：激光器数目和荧光通道数目；灵敏度：能检测最小粒子的大小；能检测细胞上最少的荧光分子的数量（MESF）；分辨率：衡量仪器测量精度的指标（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子个数；常用流式细胞仪术语©2011MindrayConfidential25目录流式样本的前处理流式细胞仪的结构域原理流式细胞仪的定义和分类流式数据的获取和分析©2011MindrayConfidential26流式细胞仪实验流程全血抗凝血培养细胞新鲜组织石蜡包埋组织体液单细胞悬液荧光抗体标记上机检测酶消化法机械法化学处理法细胞膜抗原标记细胞浆抗原标记膜浆抗原同时标记单色标记多色标记©2011MindrayConfidential27目录流式数据的获取和分析流式细胞仪的结构域原理流式细胞仪的定义和分类流式样本的前处理©2011MindrayConfidential28流式细胞仪上机流程开机建立模板仪器设置采集数据仪器质控©2011MindrayConfidential29流速停止条件电压阈值•PD或PMT控制•可由用户调节•各通道互不干扰•图像上目标细胞位置随电压变化实时更改•调整原则：通常使目标细胞位于中央或靠近中央位置•各通道均可设置•单通道阈值设置•多通道or\and组合•去除噪声及碎片•低、中、高速•低速样本流最稳定•高速收集速度最快•时间•体积•粒子数•特定目标细胞团•在选定条件点自动停止测试仪器设置用户可通过PC端软件进行以下条件的设置，并可直观观察到变化，从而获得满意的结果。©2011MindrayConfidential30主要作用：数据分析、显示主要部件：电脑工作站数据分析要素图门数据统计©2011MindrayConfidential31•图—类型直方图散点图等高线图密度图三维立体图©2011MindrayConfidential32•图——坐标轴显示线性坐标：将数据均匀的映射到各个像素点；一般用于显示FSC和SSC数据对数坐标：数据做对数变换后均匀的映射到各个像素点可以将大数据在坐标轴上压缩，小数据在坐标轴上拉伸可用于阳性标定范围广、但阴性标定信号低，线性坐标不易于分辨的情况双指数坐标：数据做双指数变换后均匀的映射到各个像素点双指数可解决对数坐标表示时小的部分过于放大及无法显示负数的问题线性对数双指数©2011MindrayConfidential33设门：在细胞分布图中确定一个范围，对感兴趣的细胞进行单参数或多参数析，获得门内细胞的百分比等参数•门不规则门&十字门区间门&二分门©2011MindrayConfidential34细胞百分比、绝对值均值、标准差、CV……•结果以何种形式呈现——统计参数©2011MindrayConfidential35FITC530/30PE585/40•数据分析——荧光补偿++FITC通道信号=PE通道信号=实测实测真实真实流式细胞仪上进行荧光检测时，几个相邻荧光通道间会发生荧光相互干扰的问题。荧光补偿是指修正由其它荧光通道渗漏到目标通道的荧光的过程。©2011MindrayConfidential36•数据分析——荧光补偿未补偿补偿合适补偿过度FL1FL21234FL1FL21234FL1FL21234FL1FL21234©2011MindrayConfidential37谢谢！