搜索
碱性磷酸酶的分离纯化有机溶剂分步沉淀法分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中），AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），原理：操作一、取材及匀浆取兔肝2g，剪碎，加入6ml0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分匀浆。记录体积（取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）二、提取加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过滤，留上清。计体积。三、分离纯化1、50％丙酮沉淀AKP加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，加4ml0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作B液，稀释10倍）2、30％乙醇溶解AKP每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml2000rpm×5min，留上清（记录体积）3、60％乙醇沉淀AKP每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml3000rpm×5min，留沉淀，加3ml0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。（取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）4、33％丙酮溶解AKP每ml溶液中加入0.33ml丙酮2000rpm×5min，留上清（记录体积）5、50％丙酮沉淀AKP每ml溶液中加入0.36ml丙酮3000rpm×15min，留沉淀，5mlPh8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀（D液，不稀释）四、分析及鉴定1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法）3、比活性及纯化倍数计算分光光度法（Spectrophotometry）根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法（Absorptionspectrometry）。不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来（一）基本原理光具有波粒二相性。波长和频率是光的波动性的特征。1、光的基本知识紫外分光光度计（200－400nm）可见光分光光度计（400－760nm）红外分光光度计（760－1000nm）2、定量分析的理论基础－－Lambert—Beer定律A＝K·L·C吸光度(Aabsorbance,A)消光度(degreeofextinction,E)光密度(opticaldensity,D)K--吸光系数,是物质的特征性常数。对比法进行定量分析A样=K·L·C样A标=K·L·C标A样A标K·L·C样K·L·C标C样C标C样=A样·C标/A标单色光、平行光（λmax）溶液均匀、清澈、无散射溶液性质稳定，比色皿中无化学反应适用于稀溶液（A0.2-0.7）Lambert—Beer定律的适用范围：溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。试剂空白：当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这种方式最为常用。参比溶液的选择基本组件及常见分光光度计分光光度计的使用1.打开电源预热15分钟2.选择波长（λmax）3.光标指向Trans4.打开光门，调节0％；关上光门调节100％5.重复4一次6.将光标指向ABS7.读数磷酸苯二钠碱性磷酸酶苯酚+磷酸盐碱性苯酚+4-氨基安替吡啉+铁氰化钾红色醌式化合物AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法单位（ml）空白管标准管ABCD各阶段稀释液酚标准液（0.1mg/ml）Tris-醋酸镁复合底物液//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////333333酶活性单位（U/ml）=A样A标×0.1×稀释倍数37保温15分钟各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min510nm比色酚标准液浓度稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液）//251051蛋白含量测定基本原理－－BCA法蛋白质+Cu2＋碱性BCA试剂紫色化合物Cu＋二喹啉甲酸，BCA单位（ml）空白管标准管ABCD各阶段稀释液蛋白标准液（0.2mg/ml）蒸馏水BCA试剂//0.10.10.10.1/0.1////0.1/////1.51.51.51.51.51.5蛋白含量（mg/ml）=A样A标×0.2×稀释倍数37保温30分钟562nm比色蛋白标准液浓度稀释倍数(PH8.8tris醋酸镁溶液）//502051碱性磷酸酶比活性（U/mg）=样品的酶活性单位样品的蛋白含量纯化倍数=每一步比活性初提液比活性得率=每一步总活性初提液总活性计算每一步总活性=酶活性×每一部记录的体积数