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1.1光镊技术简介光镊是以激光的力学效应为基础的一种物理工具，是利用强会聚的光场与微粒相互作用时形成的光学势阱来俘获粒子的【4】。1969年，A.Ashkin等首次实现了激光驱动微米粒子的实验。此后他又发现微粒会在横向被吸入光束（微粒的折射率大于周围介质的折射率）。在对这两种现象研究的基础上，Ashkin提出了利用光压操纵微粒的思想，并用两束相向照射的激光，首次实现了对水溶液中玻璃小球的捕获，建立了第一套利用光压操纵微粒的工具。1986年，A.Ashkin等人又发现，单独一束强聚焦的激光束就足以形成三维稳定的光学势阱，可以吸引微粒并把它局限在焦点附近，于是第一台光镊装置就诞生了【5，6】。也因此，光镊的正式名称为“单光束梯度力势阱”（single-beamopticalgradientforcetrap）。由于使用光镊来捕获操纵样品具有非接触性、无机械损伤等优点，这使得光镊在生物学领域表现出了突出的优势。这些年来，随着研究的深入和技术的不断完善，光镊在生物学的应用对象由细胞和细胞器逐步扩展到了大分子和单分子等。目前，光镊常被用来研究生物过程中的细胞和分子的运动过程【7-10】，也常被用来测量生物过程中的一些力学特征【11-14】。1.2光镊的原理与特点众所周知，光具有能量和动量，但是在实际应用中人们经常利用了光的能量，却很少利用光的动量。究其原因，这主要是因为在生活中我们接触到的自然光和照明光等的力学效应都很小，无法引起人们可以直接感受到或观察到的宏观效应。而科学家们利用激光所具有的高亮度和优良的方向性，使得光的力学效应在显微镜下显现了出来，在这里我们要介绍的光镊技术正是以这种光的力学效应为基础发展起来的。1.2.1光压与单光束梯度力光阱光与物质相互作用的过程中既有能量的传递，也有动量的传递，动量的传递常常表现为压力，简称光压。1987年，麦克斯韦根据电磁波理论论证了光压的存在，并推导出了光压力的计算公式。1901年，俄国人П.Н.列别捷夫用悬在细丝下的悬体实现了光压的实验测量【15】。此后，美国物理学家尼克尔、霍尔也图1.1单光束梯度力光阱分别测量了光压【16】。20世纪70年代，人们开始研究激光的辐射压力，并发展了原子束的激光偏转【17】、激光冷却【18】、光子粘团【19】等实验技术。在宏观微粒的光压力研究方面，由光悬浮发展到光捕获、光致旋转等【20】。1970年，A.Ashkin【21】首次实现了水溶液中的光悬浮。随后的一些研究【22-25】最终导致了光镊的发明。通常光对物体的作用力都是推力。但是，在一定条件下光也可以对物体产生拉力，或更一般的，产生束缚力。这就牵涉到光对物体作用的梯度力。为了阐明梯度力的概念，以透明介质小球为例说明。如图1.1所示，一个透明介质小球处于一个高斯分布的非均匀会聚光场中，小球的折射率大于周围介质的折射率。当会聚激光束照射到微粒上时，激光发生折射和反射，也包括一部分吸收。被微粒反射和吸收的光作用就是光辐射压力，或者称散射力，其方向与光传播方向一致，它趋向于使小球沿光束传播方向运动。与此同时，光束经过微粒会发生多次折射，有些会聚光线折射后传播方向更趋向于光轴（即光束传播方向），从而增大了轴向动量，因而给与微粒与光传播方向相反的作用力，表现为拉力，这就是轴向梯度力的本质，由于此拉力的作用，导致粒子在轴向可以稳定在激光焦点附近。而微粒在横向的偏离，由于光场的非均匀性，也会受到指向激光焦点的回复力，即横向梯度力。在梯度力和散射力的共同作用下，微粒被稳定束缚在激光焦点附近。这就是单光束梯度力光阱。1.2.2光镊技术的特点光镊是对单光束梯度力光阱的形象的称呼，因为它与宏观的机械镊子具有相似的操控物体的功能。但与宏观的机械镊子相比，或者与传统的操控微纳米粒子的显微微针或原子力显微镜等相比，光镊具有不可比拟的优越性。光镊对微粒的操控是非接触的遥控方式，不会给对象造成机械损伤。这使得光镊在生物学研究特别是单细胞单分子研究领域应用非常合适。首先，光镊捕获微粒的尺度在几十纳米到几十微米，正好是生物细胞、细胞器以及生物大分子的尺度范围。其次，光镊的温和操控不会损失细胞，虽然激光会产生热，但可以通过选择合适的波长，避开细胞对光的吸收波长，将热效应降到最低。另外，由于大部分细胞膜是透明的，光可以穿过细胞膜操控细胞内部微粒，这是其他操控手段无法做到的。光镊不仅可以操控微粒，还可以进行微小力的测量，粒子偏离捕获中心的距离和其受到的回复力成正比，类似与弹簧，在操控过程中能实时感应俘获粒子的微小负荷。因此，光镊是极其灵敏的力传感器，其作为微小力的探针，可以进行细胞和生物大分子之间的相互作用的定量测量，进一步揭示细胞的功能以及活动规律。3.2单个光镊的光路设计在我们设计的纳米光镊系统中将配备多个光镊。而每个光镊的光路设计都遵循相同的设计要求。即激光束从光源出射开始，到通过物镜形成光镊，中间所经过的耦合光路，要保证物镜输出的光束会聚度最大、像差最小，形成的光镊捕获效果最好。为此要求物镜后瞳能被光束完全充满，以便提高光镊捕获性能。本节以HeNe激光光镊为例，详细讨论单个光镊的光路设计。图3.2为HeNe激光光镊的光路简图。我们采用的倒置显微镜的光路为无穷远系统，因此激光进入物镜后瞳时应是平行光束。显微镜中有个固定在镜体内的透镜－焦距150mm的辅助透镜T。它必须作为光镊系统中的一部分参与到光路设计中。为了得到尽可能大的激光束会聚度，即油浸物镜数值孔径NA所许可的最大图3.2：HeNe光镊光路示意图会聚角度，激光器输出的光束必须被扩束，以满足耦合光路对光束直径的要求。当物镜像侧的孔径（后瞳）被高斯光束恰当地照明时，光束将会被聚焦为衍射极限的焦斑。物镜出射光束的理想会聚角度为126度，由001.272可得理想束腰0为363nm。本装置中使用了一个10（如图3.2,由透镜L1和L2组成）扩束器。HeNe激光器发出的激光束直径为0.65mm，经过扩束后光束直径为6.5mm。该光束被焦距250mm的透镜L3会聚到物平面的共轭面C（该平面的位置为显微镜左侧的CCD接收靶面的位置）上，然后通过CCD通道进入显微镜，被45度二向色反射镜反射，再经过辅助透镜T后，变换为合适直径的平行光束进入物镜O的后瞳，在物镜的物平面形成会聚点，在该点附近形成了光镊。在实际光路的设计中，除了要保证物镜后瞳被光束充满，我们还需要考虑下列情况：阱位与焦点位置并不一致。为了保证被捕获的微粒能够清晰成像到观测平面上，激光束经过物镜后的会聚点应适当偏离物平面，而使阱位落在物平面上。通常被捕获微粒的比重大于周围液体，因此要求阱位也即物平面在焦点之内。上面描述的光路和元件参数就是基于这样的考虑，经过实验测量确定的。我们改变了光路中HeNe光束的扩束情况，使激光束经过扩束镜后并不是平行光束，而透镜L3和辅助透镜T之间的距离也被改变，并不严格等于该两枚透镜的焦距之和。最后到达物镜后瞳处的激光束并不平行，光斑直径约为6mm，稍大于物镜后瞳（5mm）。光束的焦点落在物平面之外，保证了被捕获样品的清晰成像。保证了被捕获样品的成像状态和光镊的捕获性能，并且由于进入物镜后瞳的光斑稍大，这就使得当入射激光束有少许偏转的时候，物镜后瞳依然能保持充满，光镊性能受到的影响较小。出于光镊光路调整的需要，也是为了在必要时对阱位作横向调节，光路中还插入了两个可进行俯仰、左右二维调整的反射镜。同样，必要时可通过对扩束镜中透镜位置的纵向（激光传播方向）调节实现光镊阱位在纵向的移动，这些将在后文中进行详细介绍。3.3多光镊的光路设计在多光镊系统的设计中，耦合光路要能地将多个光镊有机地耦合在一起，而不影响它们的独立操控。目前所使用的多光镊装置，可以分为两大类。第一，单光镊的分时复用：这种方式是在单光镊的基础上，在光镊中加入一个光学扫描部件，使单光镊依次反复在多个位置间进行快速的切换［7，8］。每一个位置都按次序使用激光光源的一个时间片段。例如：光镊在初始位置捕获一个微粒，然后迅速地切换位置，在另一个位置抓住第二个微粒。按这种方式，当光镊经过若干位置后，重又回到原来的位置，只要切换速度足够快，第一个微粒还没有来得及脱离光镊捕获区域，因此又会被重新稳定在捕获位置。如此反复即实现了光镊的分时复用。这种方式的机械复杂度较高，使用的时候在光镊扫描的路线上都可以实现捕获，即可以实现多个微粒的捕获；微粒间的距离不易准确控制，不易实现光镊间相对的复杂操作。第二，多光束实现多光镊：这种方法思路简单，每个光镊都由独立的光束形成。实现方法主要有如下几种：1．对某一激光束进行分束，可以是能量分束或偏振分束。能量分束是将激光束按照能量比例分成多束。不过由于它们来源于同一激光束，分束后的激光具有好的相干性，容易发生干涉，对光捕获不利。偏振分束是将激光束分成偏振方向互相垂直的二束光［5］。这种方法简单易行、能量损耗低，得到的二束偏振光之间无干涉效应，并且也可以通过光学器件对分束后两束偏振光的能量比进行连续调节。该方法形成的双光镊稳定，但最多只能形成两个光镊；2．对同一激光束作位相变换，使激光束波前形成所需要的分布，最后可以在光场内形成多个光镊［9，10］。目前已有科研人员采用液晶位相变换器实现了多光镊［11,12］，光镊数量可以达到上百个。这种方法适应范围广，但代价较高；3．用多个激光器形成多个光镊，即采用不同波长的激光器。这对光学器件镀膜的要求较高，而且增大了光路的复杂度，因此不宜采用过多的不同波长激光。我们采用偏振分束和不同波长激光两种方法相结合来实现三光镊装置。图3.3为设计简图。作为基本设置，三个光镊既可以协同实现单个刚性微粒在空间的准确定位与定向；也可以用二个光镊操控一线形大分子、第三个光镊操控单个微粒，研究它们间的相互作用；也可以独立操控三个微粒，研究它们的相互作用。三个光镊可以同时操作，也可以相对操作，它们的相互配合能够实现各种复杂的操作组合，足以满足实际应用中的不同需求。（在设计上也为今后扩展为具备更多个光镊的系统作了考虑。）我们研制的纳米光镊装置使用了波长632.8nm的HeNe激光和波长为810nm的半导体激光二种不同波长的激光源。HeNe激光形成的光镊主要用于定量测量，通常是固定不动的。其光路已在前小节讨论，这里不再赘述。另二个光镊由同一个半导体激光器输出的激光经偏振分束后的双光束分别形成。激光束先经过一个可连续旋转的810nm的半波片，以调节光束中两个互相垂直的线偏振分量的相对强弱，即可通过旋转该半波片改变分束后双光束的功率比。然后激光束被偏振分束棱镜（PBS1）分成水平偏振和垂直偏振两束线偏振激光。这两个光束经过各自的光路，在第二个偏振分束棱镜（PBS2）处汇合为一束光。将第二块偏振分束棱镜用作光束的合成器的好处是，可以将这两束偏振方向相互垂直的线偏振激光几乎无能量损失（除了在一些界面上的反射损失）的汇合进一个光路之中。然后双光束在二向色镜处与HeNe激光束汇合。二向色镜反射810nm的激光，透射632.8nm的激光。上述三束激光一起经过辅助透镜T后，变换为平行光束进入物镜O的后瞳，由同一物镜分别形成三个光镊。每个光镊都可以实现对微米尺度粒子的捕获与操纵。3.4三维操控光镊最基本的操控是对被捕获微粒的定位和沿一定轨迹以一定速度的拖动，实际上就是对光镊阱位的操控。作为光镊操控系统的设计，首先要解决的问题就是根据实际应用的需要，选择合适的操控方式和驱动方法，实现对光镊阱位的灵活控制。对于我们研制的多光镊装置，还要考虑各光镊操控的独立性和相互配合图3.3：多光镊光路简图的问题，即实现它们相对整个装置的运动和它们之间的相对运动，以便完成各种复杂的操作动作。3.4.1操控方式和驱动方法通常有二种不同的操控方式来实现粒子与周围环境之间的相对运动。一种是光镊阱位（以及被它捕获的微粒）不动，周围环境（样品池）运动，也即对粒子而言是被动的操控；另一种是前者运动，后者不动，是主动的操控。第一种操控方式：在拖动过程中，光场分布不变，因而光镊的性能始终保持不变，这有利于对微小力进行测量。但这种方式不能改变