蛋白质结晶

蛋白质结晶及X射线衍射分析WhyCrystal?ExploretheproteinstructureX-raydiffraction:0.5-2ÅNMR:2-3ÅImmobilizeprotein,enhanceweaksignalfromscattering,maintainproteinactivity.蛋白质结晶蛋白质结晶是一个有序化过程:即蛋白质由在溶液中随机状态转变成有规则排列状态的固体.当蛋白质溶液达到过饱和状态,能够形成一定大小的晶核,溶液中的分子失去自由运动的能量(平移,旋转等),不断地结合到形成的晶核上而长成适合X衍射分析的晶体.蛋白质结晶蛋白质结晶往往在高浓度,低过饱和度情况下产生.因此高浓度的蛋白溶液,通过微调各种因素(如离子强度,pH值,温度,有机溶剂等)降低目的蛋白的溶解度,达到低过饱和度状态,有利于结晶的产生.蛋白质结晶技术微量蒸汽扩散法(浓度增加)平衡透析法(pH或离子强度)一批结晶法(沉淀剂)温度梯度结晶法(温度)重复结晶法纯化蛋白色谱法原核表达原核表达的蛋白尽量是球形,纯度很高(电泳纯)并具有活性.ProcedureForproteincrystallization蛋白质浓缩低温冷冻干燥超滤PEG/蔗糖包埋ProcedureForproteincrystallization坐滴法悬滴法ProcedureForproteincrystallization微量蒸汽扩散法ProcedureForproteincrystallizationCrystallography=science+luckyX-射线衍射分析X射线衍射分析主要内容•X射线的物理基础•X射线衍射原理（布拉格方程）1X射线的物理基础X射线的历史1895年，著名的德国物理学家伦琴发现了X射线；1912年，德国物理学家劳厄等人发现了X射线在晶体中的衍射现象，确证了X射线是一种电磁波。1912年，英国物理学家Bragg父子利用X射线衍射测定了NaCI晶体的结构，从此开创了X射线晶体结构分析的历史。1.X射线是一种电磁波，具有波粒二象性；2.X射线的波长：10－2~102Å3.X射线的（Å）、振动频峰和传播速度C（m·s-1）符合=c/X射线的性质X射线的物理基础4.X射线可看成具有一定能量E、动量P、质量m的X光流子E=hvP=h/h为普朗克常数，h=6.62617610-27尔格，是1900年普朗克在研究黑体辐射时首次引进，它是微观现象量子特性的表征。X射线的性质X射线的物理基础X射线的物理基础X射线的性质•X射线具有很高的穿透能力，可以穿过黑纸及许多对于可见光不透明的物质；•X射线肉眼不能观察到，但可以使照相底片感光。在通过一些物质时，使物质原子中的外层电子发生跃迁发出可见光；•X射线能够杀死生物细胞和组织，人体组织在受到X射线的辐射时，生理上会产生一定的反应。X射线的物理基础X射线的产生高速运动的电子流射线X射线中子流高能辐射流在突然被减速时均能产生X射线X射线的物理基础X射线管图-X射线管示意图X射线的物理基础X射线机图-X射线机的主要线路图X射线的物理基础X射线管的工作原理X射线管电子枪：产生电子并将电子束聚焦，钨丝烧成螺旋式,通以电流钨丝烧热放出自由电子。金属靶：发射x射线，阳极靶通常由传热性好熔点较高的金属材料制成，如铜、钻、镍、铁、铝等。X射线的物理基础X射线谱连续谱：强度随波长连续变化的连续谱。（见图-6）特征谱：波长一定、强度很大的特征谱特征谱只有当管电压超过一定值Vk（激发电压）时才会产生，只取决于光管的阳极靶材料，不同的靶材具有其特有的特征谱线。特征谱线又称为标识谱，即可以来标识物质元素。（见图-7）X射线谱X射线的物理基础连续X射线谱图-各管电压下W的连续谱X射线的物理基础连续X射线谱X射线连续谱的强度随着X射线管的管电压增加而增大，最大强度所对应的波长max变小，最短波长界限0减小；连续谱中接近最短波长处的辐射较多。X射线的物理基础原子结构壳层理论高能电子撞击阳极靶时，会将阳极物质原子中K层电子撞出电子壳层，在K壳层中形成空位，原子系统能量升高，使体系处于不稳定的激发态，按能量最低原理，L、M、N一层中的电子会跃人K层的空位，为保持体系能量平衡，在跃迁的同时，这些电子会将多余的能量以X射线光量子的形式释放。X射线的物理基础产生物理、化学和生化作用，引起各种效应，如：•使一些物质发出可见的荧光；•使离子固体发出黄褐色或紫色的光；•破坏物质的化学键，使新键形成，促进物质的合成•引起生物效应，导致新陈代谢发生变化；•x射线与物质之间的物理作用，可分为X射线散射和吸收。X射线与物质的作用X射线的物理基础X射线与物质作用示意图X射线与物质的作用X射线的物理基础X射线通过整个物质厚度的衰减规律：I/I0=exp(-L•d)式中I/I0称为X射线穿透系数，I/I0＜1。I/I0愈小,表示x射线被衰减的程度愈大。X射线与物质的作用二.X射线衍射原理布拉格方程平面点阵组方程:h*x+k*y+l*z=Nx，y，z为面上点阵点在a、b、c方向的坐标N为整数通过坐标原点的平面对应N=0,相邻的面N值相差±1。对于k、h、l（h=nh*，k=nk*，l=nl*）衍射，N平面上任一点P（x，y，z）与原点的光程差是:=OP·（S—So）=（xa+yb+zc）·（S—So）=xa（S—So）+yb（S—So）+zc（S—So）由劳埃方程nhnknl=?h*、k*、l*为晶面指标=xh+yk+zl=xnh*+ynk*+znl*=n(h*x+k*y+l*z)=nN相同N值面的点阵点到原点有相同光程差h*、k*、l*点阵面对于hkl的衍射是等程面面上任意两点P、Q的光程差都为零，即有=PQ·（S-So）=0说明了向量(S-So)和面上任意向量PQ互相垂直h*、k*、l*点阵面对于hkl的衍射是反射面=MB+BM=2dh*k*l*sinhkl=2dh*k*l*sinnh*nk*nl*=n(N+1)-nN=n;2dh*k*l*sinnh*nk*nl*=n布拉格方程2dsin=n衍射级数n=只有有限几个值晶胞参数与晶面间距d的关系:正交晶系,===90odh*k*l*=立方晶系a=b=cdh*k*l*=布拉格方程和劳埃方程一样能决定衍射方向与晶胞大小和形状的关系X射线衍射法测定蛋白质结构—肌红蛋白和血红蛋白结构测定X射线衍射技术对分子生物学的两大贡献1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick根据RosalindFranklinX-射线衍射实验建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构，获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖。1960年J.C.Kendrew和M.F.Perutz用X-射线衍射分析方法测定肌红蛋白和血红蛋白晶体结构，获得1962年的诺贝尔化学奖。肯德鲁(JohnCowderyKendrew)，英国生物化学家，1917年3月24日生于英国牛津。肯德鲁用特殊的X射线衍射技术及电子计算机技术描述了肌球蛋白螺旋结构中氨基酸单位的排列。他与佩鲁茨共同研究了X.射线衍射晶体照相术，还分工合作研究蛋白质和核酸的结构与功能。肯德鲁因测定了肌球蛋白的结构，而与佩鲁茨共获1962年诺贝尔化学奖，时年45岁。佩鲁茨(MaxFerdinandPerutz)，英国生物化学家。1947年他与肯德鲁合作，在剑桥创办医学研究理事会分子生物学组。他们进行血红蛋白的研究，肯德鲁分工研究肌血红蛋白分子结构，佩鲁茨研究血红蛋白。因佩鲁茨对球蛋白，特别是血红蛋白的结构进行X射线衍射分析，而与肯德鲁共获1962年诺贝尔化学奖。测定方法他们发展了X射线晶体结构分析技术，通过浸泡把重原子引入到蛋白质中，然后用同晶置换法解决位相问题，测定了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的空间精细结构。原核表达克隆,与表达载体pET21b连接,转化BL21色谱纯化chargedchelating-SepharoseFastFlowcolumnRESOURCEScolumn浓缩Centricon-30超使浓缩蛋白达到低过饱和度结晶同晶置换法：isomorphousreplacement利用引入局部置换重原子的衍生物晶体与原母体晶体间形成的同晶对在结构上的高度相似性(具有相同的空间群、相近的晶胞参数，基本相同的蛋白构象)及利用重原子在决定结构因子位相上的主导作用，结合同晶对的二套衍射实验数据进行结构解析。若以多对同晶进行结构解析，则称作多对同晶置换法。肌红蛋白结构肌红蛋白是哺乳动物肌细胞贮存和分配氧的蛋白质，分子量较小，是由153个氨基酸残基组成的一条多肽链组成的，含有一个血红素辅基。肌红蛋白分子呈扁平的菱形，分子中多肽主链由长短不等的8段直的a-螺旋组成，最长的螺旋23个残基，最短的7个残基。肌红蛋白的内部几乎都是由疏水氨基酸残基组成的，而表面既含有亲水的氨基酸残基，也含有疏水的氨基酸残基。血红素辅基处于一个由蛋白部分形成的疏水的、象个笼子似的裂隙内，血红素中的铁原子是氧结合部位。无氧的肌红蛋白称之脱氧肌红蛋白，而载氧的分子称之氧合肌红蛋白。血红蛋白结构血红蛋白主要功能是在血液中结合并转运氧气，存在于血液红细胞中。血红蛋白是由四条多肽链组成的──二条α链(每条α链含141个氨基酸残基)和二条β链(每条β链含146个氨基酸残基)。血红蛋白α链和β链的三级结构和肌红蛋白链的三级结构非常相似。每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化。Fe2+位于血红素卟啉环的中央，与卟啉环的4个吡咯基、O2及多肽链上的组氨酸形成六配位体。血红蛋白结构模型多功能X射线衍射仪（XRD）能进行高精度的物相定性、定量分析，晶体结构参数的准确测定及镶嵌块尺寸、晶格畸变、宏观内应力的测定和薄膜衍射、反射实验。高温附件能进行材料的相变过程研究。蛋白质等生物大分子的结构测定。近年随着高精密的X射线衍射仪的应用，使得大分子晶体结构的测定更加方便。X射线衍射测得多种蛋白质结构溶菌酶晶体结构（D.菲利普斯，1965）羧肽酶A晶体结构（W.N.李普斯科姆，1967）PDB数据库中的三维数已达1.5万个，其中蛋白质的比例为89.4％，X射线晶体衍射法测定的结构目占82.6％。原理:使某种蛋白质结晶所需盐的浓度与略低于这种盐浓度的蛋白质溶液在一个封闭体系内蒸发扩散,最后达到平衡而使蛋白质溶液内盐浓度增加,蛋白质溶解度降低,达到过饱和而结晶.