2.2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数——学案

12.2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数——学案一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、、pH等)，同时或其他微生物生长。(2)选择培养基：在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的是，琼脂的作用是凝固剂。②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。注意：选择培养基——在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。①在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。②培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。③改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。〖思考1〗在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素。〖思考2〗分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。〖思考3〗为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。2.统计菌落数目(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。③计算公式：每克样品中的菌株数＝CV×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。(2)显微镜直接计数法2①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。〖思考4〗如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。〖思考5〗稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。3.设置重复和对照①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用_____________作为空白对照。③对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。满足该条件的称为，未满足该条件的称为组。〖思考6〗如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？增设牛肉膏蛋白胨基础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。〖思考7〗如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。〖思考8〗请设计本实验的对照实验组：方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～90%为，主要分布在距地表的近性土壤中。2．样品的稀释样品的稀释程度将直接影响平板上生长的。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分离不同的微生物要选用不同的稀释度范围，以保证获得_________________、适于计数的平板。一般来说，细菌稀释度为_____________倍，放线菌稀释度为倍，真菌稀释度为倍。第一次实验时，可将稀释范围放宽些，以保证能从中选择出适于计数的平板。3．微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养和培养。细菌一般3在℃培养d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在℃的温度下培养d。在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取____________时的记录作为结果，以防止因_________________而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括等方面。〖思考9〗为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/Kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧型细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。〖思考10〗在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。〖思考11〗统计菌落数目的理论依据是什么？当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。〖思考12〗为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。三、操作提示1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。注意事项：①在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。②样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。③为排除非测试因素的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。④每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。四、结果分析与评价内容结果分析有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长→未被杂菌污染培养基中菌落数偏高→被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入其他杂菌选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目→选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板→操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近4五、课题延伸在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。