Western-blot-详细过程解析

温州医科大学药学院Westernblot详细过程定义：•印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。•WesternBlot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。•1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。•而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法WesternBlot基本原理WesternBlot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。WesternBlot一般流程•蛋白样品的制备•SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交洗涤二抗杂交洗涤底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液：0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+10μl泛酸钠+1μlpepstain有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备细胞数量达5×106个时就可以做WB。将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min蛋白样品制备的注意事项：煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素纯净水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Arc-Bis）SDSTris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）凝胶成份分离胶（12%）浓缩胶（4%）ddH2O4.95ml3.05mlArc-Bis6ml0.67mlTri-HCl3.75ml（PH=8.8）1.25ml（PH=6.8）10%-SDS150ul50ul10%-APS150ul50ulTEMED15ul10ul常用凝胶配置比例凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度％（W/V）分离范围（KD)3.55.0100-200080-5008.012.060-40040-20015.020.025-1506-10030.06以下SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到85V开始电泳，待marker出现6条带时将电压调到135V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。转膜膜的选择聚偏二氟乙烯膜（PVDF）硝酸纤维素膜（NC）需要用甲醇浸泡简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜膜的选择转膜半干法（用恒流）将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。转膜注意事项（一）泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板转膜条件：0.35A250V1h40min冰浴中进行转膜（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）转膜的注意事项（二）•避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。•夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。•保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。•鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深)•5％脱脂奶粉（如果用生物素标记的二抗，就不能用奶粉封闭，因为奶粉中含有生物素）•BSA（牛血清蛋白）•WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）封闭剂选择的特殊情况：（1）脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。（2）如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。（3）检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。一抗、二抗孵育•把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性）。室温不少于7小时，4℃时过夜。•回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导致膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确）。•加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动，室温避光1.5-2h•回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，纯净水洗膜5min。短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。显色反应（重组蛋白一般用磷酸酯酶AP显色或是二氨基联苯胺DAB显色，裂解液一般用ECL发光法）辣根过氧化物酶HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将印迹膜晾干扫描保存底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底，影响条带亮度过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。关于磷酸化蛋白检测的注意事项：•保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！•使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。）•请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的！当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照！抗体保存注意事项：1.收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！2.对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-200C。2.1分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。2.2复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40C，避免再冻起来！2.3绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。4.长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染任何时候，绝对避免反复冻融！WesternBlot常见问题分析SDS-PAGE电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，且竖直的拔样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温背景太高1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高原因对策1.转膜前用转移缓冲液将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度