乙肝疫苗的制备

基因工程－乙肝疫苗的制备演讲者：鞠林PPT制作者：杨秀兰李翠华欧永银资料提供者：鞠林刘珍王伟杰彭博周永斌李凯向运新朱晓东基因工程定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.获得目的基因表达载体重组的表达载体酶切、连接宿主细胞转化、转染等原核生物细胞植物细胞动物细胞卵细胞培养的动物细胞转基因动物胚胎发育药物、疫苗转基因植物转基因微生物基因工程药物人类细胞基因治疗•蛋白质名称用途•促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophichormone）治疗风湿（rheumaticdisease）•B细胞生长因子（B-cellgrowthfactor）治疗免疫系统功能失调•降钙素(calcitonin)治疗软骨病(osteomalacia)•集落刺激因子(colonystimulatingfactor)治疗血液病、肿瘤辅助治疗•绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin)治疗不排卵症•内啡肽和脑啡肽(endorphineandenkephalin)镇痛剂(analgesicagent)•上皮生长因子(epidermalgrowthfactor)促进伤口愈合•红细胞生成素(erythropoietin)治疗贫血(anemia)•凝血因子Ⅷ(factorⅧ)治疗血友病(hemophilia)•凝血因子Ⅸ(factorⅨ)治疗血友病•生长激素(growthhormone)促进生长•生长激素释放因子(growthhormonereleasingfactor)促进生长•胰岛素(insulin)治疗糖尿病(diabetes)•干扰素(interferon)抗病毒抗肿瘤•白细胞介素(interleukin)治疗癌症•基因重组乙肝疫苗用基因重组技术把乙型肝炎病毒的表面抗原（HbsAg）基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。乙肝疫苗的制备产品蛋白质的分离纯化目的基因的表达工程菌的构建目的基因的获取目的基因的获取编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取一般的目的基因的获取方法有：反转录法化学合成法反转录—聚合酶链反应法cDNA文库的建立？cDNA文库的建立TotalRNA的提取mRNA的分离cDNA双链的合成载体的制备cDNA与载体的连接重组体导入受体细胞cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定工程菌的构建•CHO细胞的特点•①具有准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子•②具有产物胞外分泌功能,便于下游产物分离纯化;•③具有重组基因的高效扩增和表达能力;•④具有贴壁生长特性,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达水平较高;•⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibrob2last),很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的后分离•材料•菌株﹑质粒及细胞•大肠杆菌DH5α和质粒pMD18-Sm（携带改变稀有密码子后的S基因）•质粒pCIneo•CHO／dhfr-细胞•pMD18-T载体•主要试剂•限制性内切酶、T4DNAligase、质粒DNA提取和柱式胶回收试剂盒•乙型肝炎表面抗原检测试剂盒•DMEM和透析胎牛血清•胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体LipofectamineTM•HBsAg血凝检测试剂盒目的基因的表达蛋白质的分离纯化细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化成品加工•浓缩与初步纯化•离子交换层析•疏水层析•亲和层析•固液分离•离心沉淀•膜过滤•双水相萃取•高度纯化•DNA的去除•热原质的去除•病毒的去除•分离纯化的基本要求•技术条件温和，保持其生物活性•选择性好，达到有效分离纯化的目的•技术间可以直接连接，节省工艺步骤•收率高，过程快•选择分离纯化方法的依据•根据产物表达形式来选择•根据分离单元之间的衔接来选择•根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺流程HIC•ButylSSepharoseFF（疏水柱层析）IEC•DEAESepharoseFF（阴离子交换柱层析）GFC•Sepharose4FF（凝胶过滤柱层析）•1、发酵液的预处理•连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩•2、疏水柱层析•介质：ButylSSepharoseFF•加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等•按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析•3、阴离子交换柱层析•介质：DEAESepharoseFF•HBsAg活性蛋白经SephadexG-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和IEC平衡液一致•按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析•4、凝胶过滤柱层析•介质：Sepharose4FF•超滤浓缩到适当体积•按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析•5、除菌•收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品谢谢观赏