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QIAGENEpiTect®Bisulfite•重亚硫酸盐处理DNA时，需要经高盐浓度、高温和低PH条件，会导致DNA断裂和片段化，并在随后的纯化过程中丢失，所以需要大量的inputDNA•重亚硫酸盐转化未甲基化的胞嘧啶，转化率超过99%•BisulfiteMix足够做8个反应，用时要将BisulfiteMix溶于800μlRNase-freewater中，溶解的BisulfiteMix在-20℃可以保存4周•DNAProtectBuffer能保护重亚硫酸盐处理的DNA在高温、低ph条件下被片段化•CarrierRNA能提高小量DNA（小于500pg，体积大于40μl）绑定在回收柱滤膜上的效率，帮助核酸沉淀；总量大于100ng的基因组DNA没有必要加CarrierRNA•EpiTectBisulfiteKit在-20℃可以保存3年；可以适用于大范围的DNA量，inputDNA范围为1ng~2μg；模板DNA片段范围可以在500bp~30kb之间ProtocolDNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上开始前的准备重点：•BisulfiteMix足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的BisulfiteMix保存于-20℃，4周内并不会影响其性能•DNAProtectBuffer在加入DNA–BisulfiteMix后会由绿变蓝（step2），表明溶液混合很充分且PH值正确•所有的离心分离步骤均在室温（15–25°C）下完成开始前准备的东西：•加入30ml乙醇（96%~100%）到BufferBW中，室温（15–25°C）保存，使用之前摇匀•加入27ml乙醇（96%~100%）到BufferBD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响BufferBD的性能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。•加入310μlRNase-freewater到冻干的carrierRNA（310μg）中，配成1μg/μl的溶液。当一次处理48个样本，将溶解的carrierRNA加入到BufferBL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。如果处理的样本较少，则将溶解的carrierRNA分装，并储存于-20℃，分装的carrierRNA能保存1年。如果少于48个样本要在2周之内完成处理，则参照表1的体积比取一定体积的BufferBL与carrierRNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrierRNA。如果BufferBL有沉淀，则需加热（最高不超过70℃）并温和搅拌使其溶解。表1BufferBL与carrierRNA的体积比•室温平衡样本和Buffers实验流程重亚硫酸盐转化DNA1.融化DNA备用，溶解BisulfiteMix，加入800μlRNase-freewater，混匀5min使其完全溶解。如有必要，60℃加热并混匀BisulfiteMix–RNase-freewater溶液使其溶解。注意不要将溶解的BisulfiteMix置于冰上。2.在200μl离心管中配制重亚硫酸盐转化反应液，参照表2配制反应体系，DNA体积不足20μl则用RNase-freewater补足。（处理低浓度DNA（1~500ng或小于500pg）时，DNA体积增加到40μl，DNAProtectBuffer减少为15μl，总体积140μl不变）表2重亚硫酸盐转化反应体系3.盖上PCR管盖，混匀反应液，置于室温（15–25°C）。DNAProtectBuffer在加入DNA–BisulfiteMix后会由绿变蓝，表明混匀充分且PH值正确。4.在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应条件参照表3。整个反应过程需要5h。表3重亚硫酸盐转化反应条件5.将PCR管放入循环加热器中，开始转化反应。注意PCR管中不要加入矿物油，保证管盖密封。已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。纯化重亚硫酸盐转化的DNA6.待转化反应完成之后，取出PCR管，瞬时离心，再将PCR管中的反应液转到一个1.5ml的干净的离心管中。转移反应液不影响其性能。7.在每个样本中加入560μl现配的BufferBL（参照表1加入10μg/mlcarrierRNA），涡流混匀并瞬时离心。如果DNA大于100ng，则不需要加入carrierRNA。（处理FFPE样本或DNA量小于500pg的样本时，加入现配的BufferBL的体积减少为310μl（加入10μg/mlcarrierRNA），混匀离心，之后再加入250μl96~100%乙醇，混匀15s后瞬时离心）8.将收集管和回收柱按样本编号并放置在架子上，将1.5ml离心管中的样本混合液全部转移到相应的回收柱内。9.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。10.在每个回收柱内加入500μlBufferBW（washbuffer），用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。11.在每个回收柱内加入500μlBufferBD（desulfonationbuffer，脱磺酸基），盖上回收柱盖子，室温（15–25°C）放置15min。如果BufferBD中有沉淀，避免将沉淀加到回收柱内。装有BufferBD的瓶子在使用后要立即盖上盖子，避免接触的空气中的CO2发生酸化。12.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。13.在每个回收柱内加入500μlBufferBW，用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。14.重复步骤13一次。15.将回收柱放到一个新的2ml收集管中，以离心机最大转速离心1min，移除所有的残余液体。16.（推荐）将回收柱放到一个干净的1.5ml离心管中，56℃加热5min，使残余的液体完全蒸发。17.再将回收柱转移到一个新的1.5ml离心管中，在每个回收柱的滤膜上加20μlBufferEB，然后15000g（12000rpm）离心1min洗脱DNA。要增加洗脱的DNA产量，可以再加20μlBufferEB，最大转速离心洗脱一次。洗脱的DNA如果要存放不超过24h，建议2~8℃保存；如果需要存放超过24h，建议-20℃保存。使用该试剂盒洗脱的已经转化的DNA可以在-20℃保存至少3年，其质量和性能不会降低。