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细胞培养实验室构建方案（一）细胞培养实验室的设置细胞培养实验室与其他一般实验室的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。细胞培养实验室应分为以下几个区：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。1．无菌操作区（1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰，一般地理位置在最后部分。理想的无菌操作室应划为三部分：a)更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。b)缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。c)无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。（2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。净化工作台工作原理（大致相同）――通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。净化工作台应用注意：（1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。（2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。（3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。（4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。（5）注意净化区内气流的变化，一旦感到气流变弱，如酒精灯火焰不动，加大电机电压仍未见情况改变则说明滤器已被阻塞，应及时更换。一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高过滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。粗过滤器中的过滤布（无纺布）应定期清洗更换，时间应根据工作环境洁净程度而定，通常间隔3-6个月进行一次。（6）净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。（7）净化工作台应定期进行功能测试，检查净化工作台各项工作指标是否达到要求，例如进行无菌试验，定期检查台面空气的洁净度是否达标。超净工作台的无菌程度检查，超净工作台在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm平皿，在超净工作台内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将平皿半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃预培养48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入超净工作台内左、中、右各放一个；打开平皿盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将平皿盖盖好，置30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求：3个平皿上生长的菌落数平均不得超过1个。超净工作台应定期请有关部门检查其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≤5祄的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75~1.0m3/s；细菌菌落数平均1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。2．孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。3．制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。4．储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。5．清洗和消毒灭菌区清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。细胞实验室必备仪器：一、CO2培养箱CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。Thermo系列CO2培养箱具有专业的灭菌和抑菌功能。Hepa过滤器，箱体内达到100级空气质量；不锈钢抛光内胆，有效抑制微生物附着；二、纯水系统细胞培养过程中，内毒素对细胞的生长有很大的影响，水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。而常规的普通蒸馏水在玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水ddH2O是不能满足要求的，细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），因此，必须配置正式的水纯化系统，采用无内毒素纯水配制所有培养用试剂。三、超净工作台/生物安全柜细胞培养对无菌环境要求很高，与CO2培养箱一样，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。实际操作经验，我建议采用新加坡ESCO超净工作台和生物安全柜。四、液氮罐为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，胚胎干细胞ESC，诱导多能干细胞IPS，间充质干细胞MSCs，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性，同时液氮罐必需配备报警器，液氮量减少时及时添补液氮量。五、超低温冰箱细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30min，转放-20℃1hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。六、恒温水浴从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器，复苏过程中要注意水浴时间1-2min，随时观察。七、离心机细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的分离则需要高速冷冻离心机。八、移液器和细胞培养的大量耗材细胞实验中有大量频繁的移液操作，因此各种微量移液器、瓶口分配器、移液管控制器是必不可少的。各类细胞培养板、细胞培养瓶、移液管等耗材更是不可或缺的，而且一次性，用量极大。除上述仪器外，高压灭菌锅、倒置显微镜也是细胞培养的必备仪器。常用的培养器皿：培养瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。培养器皿底面（cm2）加培养液量（ml）可获细胞量96孔培养板0.320.11×10524孔培养板215×10512孔培养板4.521×1066孔培养板9.62.52.5×1064孔培养板2857×1063.5cm培养皿832.0×1066cm培养皿2155.2×1069cm培养皿491012.2×10610cm培养皿551013.7×10625cm塑料培养瓶2555×10675cm塑料培养瓶7515-302×10725ml玻璃培养瓶1543×106100ml玻璃培养瓶37.5106×106250ml玻璃培养瓶78157×1072500ml旋转培养瓶700100-1502.0×108