crispr-cas9进行全基因组的筛选

HumanCRISPRKnockoutPooledLibrary(Brunello)一、lentiCas9-Blast质粒的基本信息：由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。1.lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。2.试剂盒提取质粒，并测定浓度。二、慢病毒包装质粒1转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。2转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。4将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μlLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。6混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。7DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。10收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。11于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。12以0.45μm滤器过滤上清液于15ml离心管中。三、慢病毒转染细胞参考网址：取六孔板铺50000个细胞，37°C,5%CO2培养，待细胞长到70%，换含有8ug/mlpolybrene的培养基培养。2.慢病毒悬液用含有10ug/ml的DMEM培养基稀释。3.六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。4.孵育48~72小时。5.换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml，筛选出转染成功的细胞。抗生素浓度的摸索:用培养基稀释抗生素为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、10ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。6.持续加药筛选直到细胞不再大量，并能稳定表达Cas9。一般筛选需要1~2个星期。7.在转导sgRNA文库前2~7天改用正常培养基培养。（或者先测定MOI值后，根据MOI加病毒的量，操作可参照sgRNA的转导）四、检测病毒转染的结果1.试剂盒提取质粒2.PCR扩增（）。引物：ForwardPrimer:dCas9-F2CCAAAGAGGTGCTGGACGReversePrimer:Blast-RGCTCTTTCAATGAGGGTGGA3.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用试剂盒纯化PCR产物4.通过免疫印迹扩增，收集，裂解并测试Cas9表达的细胞群。五、lentiGuide-Puro骨架基本信息六、SgRNAlibrary的设计:在基因芯片上合成核苷酸，分离出来后，进行PCR扩增。七、把设计好的sgRNA整合到质粒上：)SgRNA文库的构建1，lentiGuide-Puro载体可以使用BsmBI和一对退火的寡核苷酸可以把sgRNA克隆到骨架中。首先把5ug的lentiviralCRISPR质粒用BsmBI混合37度，酶切30min。2，试剂盒（QIAquickGelExtractionKit）纯化酶切的质粒，并用EB或ddH2O溶解。3，sgRNA1和sgRNA2用T4链接酶连接。4，反应程序：5，把第三步的产物用无菌水或EB以1：200的比例稀释。6，质粒与sgRNA的连接整合，温室放置10min。7.异丙醇沉淀核酸，75%乙醇洗涤后，晾干，用ddH2O溶解。8.测质粒DNA的浓度。八、sgRNA文库的扩增质粒转化电感细胞试剂:•100µLelectrocompetentcells(STBL4TM,ThermoFisherScientific,11635-018)•400nglibraryplasmidDNA•4electroporationcuvettes(0.1cmgap,Bio-Rad,165-2089)•10mLSOC(1XSOC,NewEnglandBioLabs,B9020S)•4bioassayplates(500cm2,LBagar+antibiotic)•2Maxi-preps(QiagenHiSpeedMaxi,12663)•Biospreader(BactiCellSpreader,VWRInternational,60828-684)•Electroporator(MicroPulserTM,Bio-Rad,16521001．37度预热SOC培养基15min和含有100ug/mlAMP的LB培养基。2．取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。3．取400ng的质粒加入100ul的电感细胞中，充分混匀。4．取25ul混合液把电击杯放在电击仪上进行电击（1.8kv）。5．迅速在电击杯中加入1mlSOC培养液（无抗生素），然后充分混匀，移到15ml的离心管中.6．重复3次，增加SOC培养基到10ml。7．取两空离心管，分别加入5ml上述混合液。8．37度放置1h。9．取10ul的混合物做4个浓度梯度，每个稀释10倍。10．每个浓度（稀释103、104、105、106）取10ul涂布于含有100ug/mlAmp的LB培养基。11．倒置培养皿，37℃培养16－18小时。12．计算电转的效率，菌落数*稀释倍数*电感细胞数。13．第二天刮取菌落接种含有50mlLB和100ug/mlAmp培养基的锥形瓶培养，摇床37度培养过夜。九、检测扩增的质粒1.用试剂盒提取质粒，按说明书操作。并测浓度。2.双酶切质粒3.用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳后的条带的大小。十、慢病毒包装质粒1转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2x107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染2转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。4将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μlLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。6混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。7DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。10收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。11于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。12以0.45μm滤器过滤上清液于离心管中。或者：1用ddH2O溶解50mg的PEI，调PH为7.1，定容到50ml。2转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为1.8*107在45ml的DMEM培养基中。37℃、5%CO2培养箱内培养。3取一个50ml离心管混合以下物质：45加入195ul的PEI试剂，常温放置10min。6再加入25mlDMEM。7跟换新的培养基848h后收集上清，0.45μm滤器过滤上清液于离心管中。十一、慢病毒文库转染模式细胞并进行基因筛选1.测定最适的MOI(1).测定前一天，取6孔板，每个孔加4×106个细胞，和2ml含有8ug/mldpolybrene的培养基。(2)．测定病毒的浓度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。(3)．取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。(4)．六孔板的每孔吸取90μl培养基丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。(5)．24小时后，换成完全培养基2ml。小心操作，不要吹起细胞。(6)．观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。MOI=病毒量/细胞量。（确定MOI范围a．带荧光标签的慢病毒：观察荧光感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。b．不带荧光标签的慢病毒：通过抗性筛确定最适MOI值。慢病毒感染后72小时加入100ug/ml的AMP，培养3-5天，镜下观察，选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔，对应为较适宜的MOI值。）2.取病毒（最适的MOI值）感染已经稳定表达cas9的细胞系，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时,并同时转导未导入Cas9的细胞做对照。3.48h以后向细胞添加合适的选择剂量的嘌呤霉素。嘌呤霉素浓度的摸索:用培养基稀释嘌呤毒素为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、10ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。4.选择成功转导的细胞后，改成正常的完全培养基培养2~7天。（如果是crispr和cas9分开额双质粒系统，前面导入的就是携带cas9的质粒，带cas9稳定表达后，在这里后就能把构建好的sgRNA文库转染细胞，重复以后的步骤，MOI与加cas9时的相似，然后用相应的抗生素在筛选细胞。）5.提取筛选出来的细胞的基因组DNA和未转导sgRNA的细胞基因组DNA。7.基因组高通量测序和进行RIGER分析确定出几个高丰度的sgRNA，确定出目的基因。