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第五章微生物的生长繁殖与生存因子§１微生物的生长繁殖１、微生物生长繁殖的概念生长—有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞的生长体现为：细胞由小变大，细胞原生质量不断增加。多细胞的生长体现为：细胞数量增加，但个体数不增加。繁殖—通过形成无性孢子、有性孢子或裂殖使微生物个体数增加叫繁殖。菌龄—指一定生长时间微生物所表现出的生长特征，而不指细菌年龄。世代时间（代时）—细菌两次细胞分裂之间的时间，称为世代时间。例如：大肠杆菌的世代时间为17min左右，专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长，如嗜树木甲烷杆菌的世代时间为6~7d，CO2还原菌的世代时间为2d。微生物种类不同、环境条件不同，世代时间不同。一种微生物在实验室培养条件下与在自然条件中或在污水、有机固体废弃物生物处理构筑物中的世代时间不同。2研究微生物生长的方法由于微生物个体小，研究它们的生长有困难，所以多数通过培养研究其群体生长。培养方法种类：分批培养和连续培养两种。2.1分批培养分批培养：将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖。细菌生长曲线：将少量细菌接种到新鲜的、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样(例如，每2h取样1次)计数。以细菌个数或细菌数的对数或细菌的干重为纵坐标，以培养时间为横坐标，连接坐标系上各点成一条曲线，即细菌的生长曲线。细菌的生长曲线反映微生物的数量由少变多，达到高峰后又由多变少，到死亡的变化规律。细菌的生长曲线图图5-1细菌的生长曲线备注：Ⅰ停滞期Ⅱ加速期Ⅲ对数期Ⅳ减速期Ⅴ静止期Ⅵ衰亡期细菌纯培养细菌的生长曲线插入１１７页图停滞期对期数静止期静止期衰亡期（细菌纯种培养）2.1.1生长曲线各阶段的特点2.1.1.1停滞期（延迟期或适应期）特点：（１）有的产生适应酶，有的死亡。（２）生长繁殖缓慢，分裂迟缓。（３）生长曲线微微增加。停滞期长短的影响因素：（１）菌种、世代时间（２）接种量（３）接种群体菌龄（４）营养停滞期2.1.1.2对数期（指数期）特点：（１）代谢活力最强，合成物质速度最快，细菌生长旺盛。（２）增殖速度最快，细菌数量以几何级数增加。2n.n为细菌分裂的代数。（３）营养物质充分，各细胞形态正常，大小一致。（４）有毒代谢产物积累不多，对生长繁殖影响小，细菌很少死亡或不死亡。如要保持对数生长，需要定时、定量加入营养物、排除代谢产物。教学试验和发酵工业都用对数期的细胞做试验材料。对期数细菌代时计算式中：G－细菌代时n－繁殖代数t0－对数期开始时间tx－对数期后期时间N0－对数期开始（t0）时细菌数，CFU/mLNx－对数期后期（tx）时的细菌数，CFU/mLG=0.301(tx－t0)lgNx-lgN0tx－t0n＝代时计算举例：假设：t0时的细菌总数（N0）为103CFU/mL，培养10h后，细菌总数（Nx）为109CFU/mL，计算代时（G）：由计算得知：繁殖一代细菌需要30min的时间。2.1.1.3静止期（稳定期）特点：（１）新生的细胞数和死亡的细胞数相当，细菌总数达到最大值。（２）体内积累物质最多（荚膜菌形成荚膜、芽孢杆菌形成芽孢，积累储存物质，如异染粒、聚β－羟基丁酸、肝糖、脂肪粒、淀粉粒等）。（３）营养物质消耗，有毒物质积累。例1：乳酸菌，在发酵中产乳酸，使pH下降，到某一程度，对乳酸菌产生抑制危害。例2：酵母菌在代谢中产热，温度升高，酶受到影响，生长不适，死亡增加。静止期2.1.1.4衰亡期特点：（1）营养物被耗尽有毒代谢产物大量积累。（2）死亡率大于繁殖率活细菌数减少。（3）菌体多形态畸形、衰退形，有的产生芽孢。（4）进行内源呼吸因外界营养缺乏，只能消耗自身储藏物质进行内源呼吸，消耗完后死亡。（5）出现自溶现象有的微生物体内产生溶解酶，使细胞溶解。衰亡期活性污泥中的微生物生长规律活性污泥中微生物的生长规律和纯菌种的一致，它们的生长曲线相似。一般将它划分为三个阶段：*生长上升阶段（包括加速期、对数期）*生长下降阶段（包括减速期、静止期）*内源呼吸阶段（即衰亡期）•活性污泥法中的序批式间歇曝气器(SBR)是将分批培养的原理应用于污水生物处理。SBR中活性污泥的生长规律与纯菌种的类似。2.2连续培养连续培养有恒浊连续培养和恒化连续培养两种。2.2.1恒浊连续培养是一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。按试验目的，首先确定培养液的浊度保持在某一恒定值上。通过调节进水（含一定浓度的培养基）流速，使浊度达到恒定（用自动控制的浊度计测定）。以加大或降低进水流速保持培养液中细菌恒定浊度。主要用于发酵工业，以获得大量的菌体和有经济价值的代谢产物。2.2.2恒化连续培养是维持进水中的营养成分恒定，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌处于最高生长速率状态的培养方式。适用于：恒化连续培养法尤其适用于污（废）水生物处理。除了SBR法外，其余的污水生物处理均采用恒化连续培养。图5-2单级连续流曝气池F：物料，Si：入流基质，Se：出流基质，Nm：生物物质（细菌数）；V：曝气池容积连续培养过程中微生物生长规律:在废水生物处理的连续运行过程中，活性污泥中的微生物生长规律与分批培养时的规律不同。它只能是分批培养生长曲线的某一生长阶段。或对数期、静止期、衰亡期。3细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用概念：活性污泥：由多种多样的好氧微生物和兼性厌氧微生物（兼有少量的厌氧微生物）与污（废）水中有机的和无机固体物混凝交织在一起，形成的黄褐色絮状体或绒粒，菌胶团为其结构和功能中心。活性污泥法：利用人工培养的呈黄褐色絮凝状的微生物群体（活性污泥），将污水中呈溶解状和胶体状的有机物分解转化为稳定的无机物的污水生物处理方法。常规活性污泥法的工艺流程污水处理水曝气池二次沉淀池污泥回流剩余污泥生长曲线在污水生物处理中的应用项目生长上升阶段（对数期）生长下降阶段（静止期）内源呼吸阶段（衰亡期）营养物（F）F/M≧2.2F充足,过量F/M0.1~2.2F不足F/M0.1F少,污泥量少细菌量（M）几何级数增加呈下降趋势、增长慢零或负增长制约关系与F无关，0级反应与M有关，1级反应F制约M,1级反应F严重制约M污泥沉降性能活性污泥能量高，不易获得良好絮凝体，沉降性不好。较好，范德化引力占优势；形成荚膜、菌胶团；易形成絮凝体，吸附、凝聚力强。好出水水质不好，细菌多、有机物多。较好，SS低。好，SS低。应用（１）高负荷活性污泥法（2）AB法的A段（１）常规活性污泥法（２）生物吸附法（３）高负荷活性污泥法（１）延时曝气法（２）氧化沟法图5-4微生物代谢速率与F/M的关系微生物代谢速率与F/M的关系插入１２１页图1.5-5图5-5活性污泥的生长曲线及其应用①～④活性污泥生长曲线四个时期；⑤常规活性污泥法；⑥生物吸附法；⑦高负荷活性污泥法；⑧分散曝气；⑨延时曝气常规活性污泥法利用静止期的理由：为什么常规活性污泥法不利用对数期的微生物而利用静止期？对数期：①要求有机物浓度高因对数期的微生物生长繁殖快，代谢活力强，大量吸收废水中有机物。相应要求进水有机物浓度高，导致出水的绝对值相应提高，不易达到排放标准；②凝聚沉淀性能差又因对数期的微生物生长繁殖旺盛，细菌的黏液层和荚膜尚未形成，运动很活跃，不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差，致使出水水质差。静止期：①仍有较高活力降解有机物虽然静止期的微生物代谢活力比对数期的差，但仍有相当的代谢活力，去除有机物的效果仍较好；②絮凝沉淀效果好最大特点是微生物积累大量贮存物，如：异染粒、聚β－羟基丁酸、黏液层和荚膜等。强化了微生物的生物吸附能力，其自我絮凝、聚合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。延时曝气法利用衰亡期在污（废）水BOD5/CODCr0.3时，不用静止期的微生物，而利用衰亡期微生物，用延时曝气法处理低浓度有机污（废）水，其原因是：低浓度有机物满足不了静止期微生物的营养要求，处理污（废）水的效果不会好。若采用延时曝气法，延长曝气时间在8h以上，甚至24h，延长水力停留时间，适当增大进水量，提高有机负荷，才能满足微生物的营养要求。从而取得较好的处理效果。4微生物生长量的测定方法4.1测定微生物总数（包括活菌和死菌）（１）计数器直接计数（2）电子计数器计数（3）涂片染色法（４）比浊法(1)直接计数法方法：利用特定的细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：只能计数细菌数，不能区分死活菌。适于：细菌、酵母菌、藻类和原生动物血球计数板计数室：面积1mm2、高度0.1mm；有400个计数小格；计数格：1mm2又分成25(或16格)中格，每中格又分16小格(或25格)。计数方法：数个数：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，在显微镜下计算4－5个中格的细菌数，求出每个小格的细菌数。计算每ml样品的细菌数：细菌数(样品/ml)=每小格细菌平均数×400×1000×稀释倍数（2）电子计数器计数适于：较大的微生物如原生动物、藻类和非丝状的酵母菌原理：在一个小孔的两侧各放置一个电极，通电后，若有物体通过，电阻会发生变化。当细胞悬液通过小孔时，每通过一个细胞，电阻就会增加（或电导率下降）并产生一个信号，计数器就对该细胞自动计数一次。优点：精确缺点：受微小颗粒和丝状物干扰（3）涂片染色法方法：用0.01ml吸管吸取定量稀释的细菌悬液均匀涂布于刻有1cm2面积的计数板上，经固定染色后，在显微镜下观察几个视野并计数，取平均值，再按下式计算每毫升原液的细菌数：每ml原菌液的细菌数＝视野中的平均菌数×1cm2/视野面积×100×稀释倍数（４）比浊法测定细菌悬液细菌数原理：单细胞微生物的悬液浓度与浊度成正比，与光密度（OD）成反比。细胞数越多，透光度越小。方法：①用分光光度计测定菌悬液的光密度或透光度；②用浊度计测菌悬液的浊度。计算：将未知细胞数的菌悬液和已知细胞数的菌悬液相比，可求出未知菌悬液所含的细胞数。4.2测定活细菌数（1）液体稀释培养计数（2）过滤计数（3）菌落计数（1）液体稀释培养计数适于：生长较慢的细菌，如硝化细菌、铁细菌和硫酸盐还原菌等。方法：以MPN法(最大可能数法)直接用液体培养基稀释样品，每个稀释度3～5管，置于培养箱内培养1～2周，取出观察和计数。以它的阳性管（培养基浑浊）数对照检索表查得细菌数。（2）过滤计数适于：含菌量少的水样，如饮用水中的大肠菌群数的测定。方法：用0.45µm的滤膜过滤，将膜置于已倒好的平板上培养得到生长的菌落，计数。(3)菌落计数平板菌落计数（CFU）：单位容量中的细菌均匀分布在营养琼脂平板上面生长的菌落形成单位数。平板菌落计数计算：每ml原菌液活菌数＝同一稀释度三皿平均菌落数×稀释倍数×50.2ml4.3计算生长量（１）测细胞干重法在环境工程中用得较多，如测曝气池的混合液悬浮固体（MLSS）或混合液挥发性悬浮固体（MLVSS）。（２）测N法（３）测DNA法（４）生理指标法第二节微生物的生存因子一、温度温度是微生物的重要生存因子，在适宜的温度范围内，温度每提高10℃，酶促反应速率将提高l～2倍，微生物的代谢速率和生长速率均可相应提高。适宜的培养温度使微生物以最快的生长速率生长。过低或过高的温度均会降低代谢速率及生长速率。在适宜的温度范围内微生物能大量生长繁殖。根据一般微生物对温度(t)的最适生长需求，划分为四类微生物：*嗜冷菌*嗜中温菌*嗜热菌*嗜超热菌（1）影响微生物的生长速率微生物生长温度范围℃微生物最低最适最高嗜冷细菌－5~05~1020~30嗜中温细菌5~1025~4045~50嗜热细菌3050~6070~80嗜超热细菌55℃以上70~105110~113原生动物16~2537~43（少数可在60℃中生存）藻类28~30污水处理中微生物30℃左右（2）影响微生物群落、数量、代谢活性（3）高温（极端高温）影响高温对微生物有致死作用，使酶失活、蛋白质凝固变性，可利用高温杀菌。灭菌：利用高温、物