PCR技术详解

PCR技术详解一二三四五PCR简史定义基本原理反应要素PCR的类型六PCR反应流程目录八常见问题分析九PCR技术应用领域七PCR产物检测一、PCR简史•1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。•但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，未能推广•1988年，Saiki等人从嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技术得以广泛应用•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖二、定义PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高温（95℃左右）时变性成单链，低温退火（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’~3’)的方向延伸合成互补链三、基本原理PCR技术模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性———引物退火———新链延伸1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍=pcqq.c2c#paction理想拷贝数=2nn：循环次数实际拷贝数=(1+x)nX：平均效率,约为0.85n：循环次数四、反应要素1.热稳定DNA聚合酶2.引物3.模板4.dNTP5.二价阳离子6.维持pH的缓冲液1.热稳定DNA聚合酶目前有两种TaqDNA聚合酶供应：–天然酶：从栖热水生杆菌中提纯–基因工程酶：大肠杆菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100µl时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。2.引物引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.1-0.5mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；引物设计原则：④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；⑥引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过2~3℃，经验公式Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值5~10℃；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；⑧引物量：每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会3.模板模板即DNA片段,其量的多少及其纯度的高低,是PCR成败与否的关键环节之一单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模板量是1μg，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg4.dNTPdNTP在温度较高时容易失活,因此需要-20℃下冰冻保存,以保证dNTP的质量。在PCR反应中,dNTP浓度应为200～250μmol/L,尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等,否则就会引起错配过低浓度降低PCR产量，过高浓度的dNTP(大于4mmol)可能会淬灭Mg2+，从而抑制PCR反应5.二价阳离子通常为Mg2+，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，当dNTP浓度为200μmol时，Mg2+浓度在1.5mmol/L~2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度6.维持pH的缓冲液室温下pH调到8.3~8.8的Tris缓冲液常用于PCR反应，浓度在10mmol~66mmol，当72℃时（延伸温度），反应缓冲液的pH会降到约7.2，缓冲液中加入KCl，可以促进引物的退火五、PCR的类型a.标准PCRb.热启动PCRc.反向PCRd.巢式PCRe.LAPCRf.不对称PCRg.RTPCRh.实时荧光定量PCRi.多重PCRj.差异显示PCRk.锚定PCRl.原位PCRm.重组PCRn.免疫PCR…………1)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶2）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01∶0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物4）实时定量PCR(real-timePCR):该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓度实时PCR技术原理探针设计一般应符合以下条件：•①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。•②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。•③避免与引物发生杂交或重叠。•④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。•另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。6、PCR反应流程1、温度与时间的设置•设置变性-退火-延伸三个温度点•标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸，•对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。①变性温度与时间：•一般93℃～94℃，1min足以使模板变性–若低于93℃则需延长时间–但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。②退火(复性)温度与时间：•退火温度是影响PCR特异性的重要因素•退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度•对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性③延伸温度与时间：•延伸温度：一般选择在70～75℃之间–常用温度为72℃–过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。•延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）–3～4kb的靶序列需3～4min–扩增10kb需延伸至15min•延伸时间过长会导致非特异性扩增•对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2、循环次数•循环次数–决定PCR扩增程度•循环次数–主要取决于模板DNA的浓度•循环次数：选在30次左右•循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多七、PCR产物检测1.琼脂糖凝胶电泳——最常用2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.层析技术—高效液相色谱（HPLC）—离子交换层析（IEC）4.分子杂交5.限制性内切酶酶切分析6.PCR扩增产物的直接测序八、常见问题分析1.不出现扩增条带分析原因：模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产物电泳检测时间一般为48h内2.假阳性分析原因：模板或扩增产物的交叉污染3.非特异性扩增带分析原因：引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁离子浓度过高、退火温度过低、酶不合格或酶量过多4.出现片状拖尾或涂抹带分析原因：模板降解、酶不合格或酶量过多、镁离子浓度过高、退火温度过低、dNTP浓度过高、循环数过多九、PCR技术应用领域•研究–基因克隆，DNA测序，分析突变•诊断–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•人类基因组工程–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•法医–犯罪现场标本分析•肿瘤–各种肿瘤检测•其他……谢谢观赏