腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。7)实验完毕后请用香皂清洗双手。➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。注：汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装（200μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1,ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre双载体组成。一、整体实验流程二、实验材料该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1,3Cre)。1、载体信息（见附1）汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗（DMEM完全培养基）。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，则293A细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加，293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveItTM抗支原体试剂。三、腺病毒包装和浓缩（一）质粒构建和扩增构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于1g/l，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusionTM无缝克隆试剂盒。（二）腺病毒包装事先准备好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6cm的培养皿成分如下：pHBAd系列穿梭质粒2μgpBHGlox(delta)E1,3Cre4μgDMEM需在37℃水浴中预热，LipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。注：1、LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。（三）病毒收集病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果穿梭质粒带有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册空斑示意图注：高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3ml琼脂糖/培养基。（四）病毒扩增第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。注：1、收集细胞的时候一般使用细胞刮，不能用胰酶消化，4℃500g离心10min，去除大部分上清，只留取2ml上清重悬细胞沉淀进行-80℃（干冰或者液氮均可）冻融。2、37℃冻融时一旦病毒融化就马上取出，长时间在37℃温育会降低病毒滴度，完全融化后可以剧烈震荡30s。冻融周期通常会持续2~4次才可以获得高滴度的病毒。3、细胞冻融结束裂解液可以4℃500×g离心10min，不立即使用的话可以冻存在-20℃或-80℃。汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册（五）病毒纯化病毒纯化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下:1、融化：提前1天将病毒从-80℃冰箱拿出，室温水浴融化。收集全部细胞裂解物，7000×g4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清。2、PEG8000沉淀：每100ml上清加入50mlPEG8000（20%PEG8000，2.5MNaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g4℃离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20mMTris-HCl，PH8.0）（溶液配置见下表），病毒液应呈粉红色。三种不同密度CsCl溶液的配制密度（g/ml）(20℃)浓度（mg/ml）CsCl的量（g）终体积（ml）1.40548.35.483101.30402.44.024101.10143.81.438103、CsCl梯度离心：CsCl梯度的制备方法如下：加入2ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液（溶剂同上），然后再缓慢加入3ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液（配置如下表），再加入5ml的病毒悬浮液。使用BeckmanSW28转子，26,000rpm，4℃离心2小时。汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册4、收集病毒：用注射器收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中。注：透析袋使用前用10mMEDTA-Na2煮沸10min，降至室温使用。5、透析：在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml1MTris-HCl，PH8.0，2ml1MMgCl2定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。6、重悬：500μlPBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。四、测定腺病毒滴度（PFU）空斑(Plaque)是病毒诱导的细胞裂解形成的点状物，可以通过显微镜和肉眼观察。空斑形成单位(Plaque-formingunit,PFU)是单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子的浓度单位。PFU测定方法如下：293细胞铺于60mmdish，24h后细胞密度接近100%后加入不同稀释度的病毒，37℃汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册感染4~8h后，铺8ml低熔点胶（10%FBS，1.25%Agarose）。培养9~11天后对空斑进行计数来计算腺病毒滴度。注：腺病毒滴度还可以通过观测荧光蛋白（若有）或者通过目的基因的WB、免疫荧光或免疫组化等方法测定。五、感染目的细胞因为不同细胞的MOI不同，所以在正式实验前，需设计预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。注：MOI值:MOI是multiplicityofinfection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒颗粒所感染。不同实验室、不同操作手法及不同细胞系条件下所对应的细胞最佳MOI都是不同的，在正式实验之前强烈建议实验操作者进行一次摸索最佳MOI的预实验。（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞密度约为1×105/ml。注：接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%至70%之间。（二）病毒感染细胞（腺病毒感染细胞系的话可以略过纯化操作步骤）感染之前，请按照梯度稀释病毒（附2），一般感染时MOI控制在3~1000区间范围。1、感染贴壁细胞汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册感染实验分为两组，分别添加带目的基因的腺病毒和等滴度同体积的对照病毒，常用孔板参数如下表（简而言之，就是把一定体积的病毒直接加入到完全培养基中即可）。加入的病毒量范围在MOI=3～1000，一般设置MOI摸索梯度为3，10，30，100，300，1000（详见附2）。每个MOI值加两个孔，4~8h后更换成新鲜完全培养基。举例：假如收到的病毒滴度为51011PFU/ml,首先用完全培养基稀释到51010PFU/ml（1：10稀释）。现在要感染细胞数1105/孔一个孔，MOI=1000，则需要51010PFU/ml病毒的体积=11051000/51010ml=2l。直接吸取2l的51010PFU/ml病毒混入孔板的培养基中即可。混匀后继续培养4-8hr后更换新鲜的完全培养基。48-72hr可以观察荧光、WB等实验。注：遗弃的废液按照病毒废液来处理！腺病毒小体积感染表培养皿类型表面积/cm2培养基体积腺病毒体积96-well0.3cm2100µl0.1-0.5µl24-well2cm250