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高效液相色谱基础知识主讲侯建军一、简介色谱学是现代分离分析的一个重要领域，也是一门新兴学科，在化学、生物学等领域发挥着越来越重要的地位。近几十年来，色谱学各分支，如气相色谱、液相色谱、薄层色谱等研究方法都得到了深入的研究，20世纪50年代创立了气相色谱法，它的出现把色谱法从分离技术提高到分离与“在线”分析的新水平，为色谱法成为现代分离-分析方法奠定了基础，1957年诞生了毛细管色谱法。20世纪60年代推出了色谱-质谱联用技术（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱点，成为最重要的分离分析方法之一，LC-MS在选择性、灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究（包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如蛋白异常的研究）。LC-MS已成为新药研究必不可少的手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把色谱法推进到一个新水平。高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是一种高效、快速的分离分析技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。HPLC的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离天然药物的有效成分，或制备手性药物的单一对应体。由于使用各种高灵敏度的检测器，如荧光、电化学和化学发光检测器，再结合许多衍生化技术及样品富集技术，HPLC对许多药物的最低检测限都达到了pg级或更低水平，非常适合于一些微量成分甚至痕量成分的分析。由于色谱条件的可控制性及进样技术和在线样品处理技术的发展，HPLC分析的精密度完全能够满足医药分析实验室的要求。HPLC一般在数分钟至数十分钟内即可完成一个样品分析，而且往往能够实现多组分的同时测定，这一快速分析的特点使HPLC广泛应用于药物合成的各部反应的监控和临床治疗药物的监测。HPLC的柱切换技术是通过程序控制的切换阀改变流动相的流向和（或）流动相系统的技术。这一技术在医药分析中的应用越来越多，尤其在药物分析中的应用最为广泛。利用柱切换技术可以实现样品的在线净化与富集、在线衍生化、在多个色谱柱上进行分离。在复杂样品的分析方面有着巨大的潜力。目前，高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工、业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学家和生物化学家手中用以解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。液相色谱根据固定相性质可分为离子交换色谱、吸附色谱、键合相色谱和大小排阻色谱。离子交换色谱法是流动相中的被分离离子，与作为固定相的离子交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，它们对交换剂的基体离子亲和力的不同而达到分离的。组分离子对交换剂基体离子亲和力越大，保留时间就越长。吸附色谱法是当组分分子流经固定相（吸附剂，如硅胶或氧化铝）时，不同组分分子、流动相分子就要对吸附剂表面的活性中心展开竞争。这种竞争能力的大小，决定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。大小排阻色谱法的固定相是一类孔径大小有一定范围的多孔材料。被分离的分子大小不同，它们扩散渗入多孔材料的容易程度不同。小分子最易扩散进入细孔中，保留时间最长；大分子完全排斥在孔外，随流动相很快流出，保留时间最短。在以上四种分离方式中，反相键合相色谱应用最广，因为它采用醇—水或腈—水体系作流动相。纯水易得廉价，它的紫外吸收极小。在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37—）键合到硅胶表面。这种键合相又称ODS（Octadecylsilyl）键合相，如国外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-packCLC-ODS，国产的YWG-C18等。二、基本概念和术语一、色谱图和峰参数1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。2、基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要由流动相中的杂质等因素决定。3、噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。4、漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。5、色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。6、拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。7、峰底-基线上峰的起点至终点的距离。8、峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。9、峰宽（peakwidth，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ10、半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ11、标准偏差（standarddeviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。12、峰面积(peakarea，A)-峰与峰底所包围的面积。二、定性参数（保留值）1、死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。2、死体积(deadvolume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）3、保留时间(retentiontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。4、保留体积(retentionvolume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR5、调整保留时间(adjustedretentiontime，t'R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reducedretentiontime)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t06、调整保留体积(adjustedretentionvolume，V‘R)--扣除死体积后的保留体积。三、柱效参数1、理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。1.1用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。1.2N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）1.3若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。2、理论塔板高度(theoreticalplateheight，H)--每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。四相平衡参数1、分配系数(distributioncoefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相（Cs）与流动相（Cm）中的浓度之比。K=Cs/Cm分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。2、容量因子(capacityfactor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t‘R）是不保留组分保留时间（t0)的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t’R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长3、选择性因子(selectivityfactor，α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。五、分离参数分离度(resolution，R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1＝W2时，R＝0；当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离；R＝1.5时，称为6σ分离。R≥1.5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。三、基本分析方法高效液相色谱法在医药领域中的应用非常广泛，它能用于化学合成药物的含量测定和杂质限量分析，用于中草药和中成药的定性鉴别和有效成分或指标成分的测定，也用于制剂分析，还用于药物代谢和动力学研究。此外，HPLC还广泛用于天然药物有效成份的分离制备和纯化。这些方法主要分为：定性分析、定量分析、杂质分析。对于任何方法都必须进行验证和评价。一HPLC分析方法的参数及验证1.专一性专一性（specificity）又称为特效性，是指在可能存在诸多干扰组分时方法明确确定被分析组分的能力，分析含有和不含有干扰组分的样品，比较分析结果，其差异即是方法