高效液相色谱法测定酸奶中四种有机酸

高效液相色谱法测定酸奶中四种有机酸Determinationof4organicacidsinyogurtbyhigh-performanceliquidchromatography田辉1,2孙懿琳1,2周元良1,2霍贵成1,2TIANHui1,2SUNYi-lin1,2ZHOUYuan-liang1,2HUOGui-cheng1,2（1.乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）(1.KeyLaboratoryofDairyScience,MinistryofEducation,Harbin,Heilongjiang150030,China;2.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang150030,China)摘要：测定酸奶中风味有机酸，精确评价酸奶风味，并对比3种发酵剂的发酵性能。使用3种直投式发酵剂以半工业化方式生产酸奶，测定3种酸奶在发酵及冷藏过程中的酸度变化，感官评定酸奶成品，并通过高效液相色谱法（HPLC）分析酸奶中的4种有机酸成分（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸）。结果表明：3种发酵剂产酸迅速，所产酸奶品质优良，M与自制发酵剂后酸化弱。冷藏期间3种酸奶中有机酸含量的变化存在细微差异。利用高效液相色谱法有效测定了酸奶中4种有机酸（乳酸、柠檬酸、丙酮酸及甲酸），成功评定了3种发酵剂的的发酵性能。关键词：高效液相色谱；有机酸；酸奶；感官评定Abstract:Theresearchistodeterminetheorganicacidsinyogurtbyhigh-performanceliquidchromatography(HPLC),evaluatetheflavorofyogurtbysensoryevaluation,andcomparetheperformancesof3cultures.Threekindsofdirect-vat-setcultureswereusedtoproduceyogurtrespectivelyinasemi-industrializedway,andthentheaciditiesofyogurtduringfermentationweredetermined.Sensoryevaluationwasmadetoassessthequalityofyogurt,and4kindsoforganicacids(lactic,citric,pyruvicandformicacids)inyogurtsweredeterminedbyHPLC.Results:Itshowedthatall3cultureshadquickacidityproduction,andallyogurtwasprovedtoholdhighqualities.ThecultureMandtheself-madecultureshowedaweakpostacidificationwhileNcultureshowedstrong.Somedifferencesoftheorganicacidscontentsamong3kindsofyogurtwereobserved.4organicacids(lactic,citric,pyruvicandformicacids)inyogurtweredeterminedeffectivelybyHPLC,andtheperformancesof3cultures基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目（编号：IRT0959）作者简介：田辉(1984—)，男，东北农业大学在读博士研究生。E-mail：[e-mail]通讯作者：霍贵成2012-10-1617:38:high-performanceliquidchromatography;organicacid;yogurt;sensoryevaluation酸奶作为一种时尚的健康食品被越来越多的人所喜爱[1]，而优良的风味是其被消费者接受的前题，其中有机酸是酸奶风味物质中的重要成分。乳制品中天然有机酸的来源主要有：乳脂肪的水解（自由脂肪酸如乙酸、丁酸），牛的生理代谢（柠檬酸、乳清酸、尿酸），以及细菌代谢（乳酸、乙酸、丙酮酸、丙酸、甲酸）。乳酸菌的分解代谢也会产生这些产物，同型乳酸发酵将几乎全部的碳源经丙酮酸代谢转化为乳酸，也可以产生其它有机酸及风味代谢产物[2]。有机酸的产生，抑制了有害菌的繁殖，提高了食品的安全性，同时还是发酵乳风味的重要来源[3]。对酸奶中有机酸成分进行定性和定量分析，有助于人们更好地对生产过程与产品品质进行控制，同时，随着酸奶发酵剂研究的逐渐兴起[4]，准确分析乳酸菌的有机酸代谢将有利于优良发酵剂的筛选与选育。本试验以硝酸法处理酸奶样品，采用高效液相色谱法（HPLC）对酸奶中4种有机酸进行定性和定量的检测，对比3种酸奶中有机酸成分的差异，为酸奶的风味分析及酸奶发酵剂的性能评价提供了理论根据。1材料与方法1.1材料与仪器商业直投式发酵剂M：工业生产用，市售；商业直投式发酵剂N：家庭用，市售；自制发酵剂：本实验室研制；鲜牛奶：阿城牧场；蔗糖：市售食品级；乳酸、甲酸、丙酮酸：色谱纯纯（99.5%），美国Sigma公司；氢氧化钠、硝酸、冰乙酸：分析纯，天津化学试剂一厂。生化培养箱，GL-20G-Ⅱ，上海佳胜实验设备有限公司；冰箱，HVE-50，海尔集团；pH计，DELTA320，美国MettlerToledo公司；高效液相色谱仪，2695，美国Waters公司；色谱柱，HPX-87H，美国Bio-RAD公司；离心机，GL-21M，上海市离心机械研究所。1.2试验方法1.2.1半工业化生产酸奶鲜牛奶在乳品车间生产线进行前处理、冷却与投菌，分别经过滤、加蔗糖（6%）、标准化、均质、灭菌，最后冷却至43℃，分别将M、N及自制发酵剂接入灭菌乳中并搅拌均匀，迅速分装至30个100mL无菌小烧杯中，置于43℃恒温箱中发酵。每隔1h分别取出3种酸奶中3个平行小烧杯，测定pH值。待pH4.3～4.4时，将该组样品迅速转移至4℃冰箱冷藏。冷藏1d时取样品进行感官评定。冷藏1，5，9，13d取样测定pH，同时进行风味有机酸分析，每种酸奶3个平行。1.2.2酸度测定取小烧杯样品，将酸奶轻轻搅拌均匀，分别取出约15mL进行酸度测定。其中pH值采用DELTA320精密pH计直接测定；滴定酸度采用GB5413.34——2010，每个样品测定3次，计算平均值。1.2.3感官评定参照美国农业部（USDA）评定瑞士酸奶扣分卡系统[5]，并作相应修改,见表1，对冷藏1d的3种酸奶分别进行感官评定。评定系统分为风味、组织结构和表观三部分，针对每项采取扣分制原则，扣分越多表明产品缺陷就越多。选择有感官评定基础知识和经验者10人，在酸奶搅拌前进行表观评定，再将酸奶轻轻搅拌均匀进行组织结构评定，最后进行风味评定，计算平均值，并利用SPSS16.0软件通过单因素方差分析，分别对风味、组织结构和表观评分进行差异显著性分析。表1感官评定扣分详细表Table1PunishmentoftheOrganolepticEvaluation评定项目扣分指标（风味每项扣1～10分，组织结构与表观每项扣1～5分）风味1.苦味；2.蒸煮味；3.外来异味；4.涩味；5.过酸；6.甜度过高；7.风味不正；8.酸度不足；9.甜度过低；10.原料陈旧味；11.有酵母味；12.氧化味；13.酸败味；14.不洁净味；15.不自然风味组织结构1.有颗粒；2.过软表观1.析出乳清；2.表面不平整；3.皱缩1.2.4有机酸的测定采用高效液相色谱法[6]。(1)样品处理：3mL酸奶与50μL的68%硝酸混合，再用1mL的5mM的流动相硫酸稀释。14000×g离心30min。用1mL注射器吸取中间层清液，经0.22μm滤膜过滤到进样瓶中约1.5mL。每个样品3个平行处理。(2)机器参数：5mMH2SO4的流动相，0.5mL/min流速，10μL进样量，检测温度35℃，树脂基柱，最大柱压1500Pa，每个样品检测时间25min，紫外吸收检测器，检测波长210nm。(3)操作要点：开启机器并运行至基线平稳后开始进样。用1mg/mL标准样品确定保留时间，再根据样品中相应峰的面积，每个标样配制5个梯度浓度，使在样品中浓度范围附近。每个浓度标样测定平行测定3次，并计算平均值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，利用Excel软件绘制标准曲线。待测样品每个样品平行测定3次，计算平均值，通过回归方程计算浓度。2结果与分析2.1发酵过程中的酸度变化发酵期间的酸度变化是发酵剂活力的体现，直投式发酵剂由于经过冷冻干燥处理，活菌数和菌活力降低。初始活菌数（即接种量）低、菌活力恢复慢，会导致延迟期增加，进而会增加生产成本，甚至影响酸奶品质。因此，乳酸菌活力的迅速恢复是直投式发酵剂的首要性能。0h（未发酵）奶的pH为6.58，滴定酸度为15.63°T，如图1所示，发酵剂在1h左右就进入对数期，可见发酵剂活力恢复较快。4h后酸度平缓增加，而这种趋势非常利于控制发酵的终止。5h时自制发酵剂与商业发酵剂H发酵pH值分别达到4.32，4.34，滴定酸度分别为91.9，86°T。而家庭式发酵剂产酸较慢，至5.5h时pH值达到4.39滴定酸度91.7°T。一般来说，酸奶pH范围为4.2～4.5，乳酸最大量在0.9%（即100°T）左右[7]，均符合酸度要求。44.555.566.570123456020406080100时间Time/hourpH滴定酸度TitrationAcid/°TN-pHM-pH自制-pHNM自制图1发酵过程中酸奶的酸度变化Fig.1AcidityofYogurtduringFermentation2.2冷藏期间的酸度变化由图2可知，两种商业发酵剂和自制发酵剂生产酸奶，其pH值在前9d为下降趋势，第9天至13天保持稳定。工业用直投式发酵剂M与自制发酵剂在冷藏过程中，后酸化现象较弱，前9dpH分别由4.34和4.39下降至4.16和4.15。而家庭用直投式发酵剂N的后酸化较强，到第9天，pH已降至3.98，说明发酵剂N作为家庭用发酵剂，虽然在产品风味与质构方面达到较高水平，但只能在短时间内食用。3.944.14.24.34.44.501591360708090100110120130时间Time/daypH滴定酸度TitrationAcid/°TMpHNpH自制pHM滴定N滴定自制滴定图2冷藏期间酸奶的酸度变化Fig.2AcidchangesofYogurtduringCold-storage酸奶后酸化的原因，主要由保加利亚乳杆菌在冷藏期间继续产酸导致，低温和低pH环境使嗜热链球菌的代谢被抑制，但保加利亚乳杆菌由于具有较强的耐酸力，虽然低温一定程度降低了乳酸菌产酸关键酶活力，但代谢活动并未完全停止。产酸关键酶活力与后酸化之间存在紧密联系，如果保加利亚乳杆菌中酸代谢中的酶在低温下失去活力或很弱，那其所产酸奶的后酸化就会很弱。通过试验结果可知，自制发酵剂中的保加利亚乳杆菌为一株弱后酸化菌株，弱后酸化能力与商业发酵剂不相上下。2.3感官评定由表2可知，3种酸奶在风味、组织结构和表观方面虽然有差异，但差异不显著（P0.05），其中，组织结构和表观相差不大，都达到了较高水平。在风味方面，发酵剂N与自制发酵剂所产酸奶扣分略高于发酵剂M所产酸奶，而扣分主要集中在酸味方面。感官评定时间为冷藏1d，此时3种酸奶酸度都在适宜范围内，但发酵剂N所产酸奶酸度略高于发酵剂M与自制发酵剂所产酸奶，而自制发酵剂的酸味稍偏于柔和，可能与有机酸中不同成分的比例