搜索
选修1《生物技术实践》知识点归纳实验1大肠杆菌的培养和分离1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核,只有一环状DMA分子(拟核)。以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的分离方法有两种:划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线的过程中菌液逐渐减少,细菌也逐渐减少,。划线最后,可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10~20小时后,一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞,形成菌落,不会重叠。在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分离时,需要先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍之间,然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落，每个培养基里有20个以内的单菌落为最合适。优点：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。在培养微生物时,必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的,各种培养基也必须是无菌的,转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌(防止杂菌污染)。进行恒温培养时,要将培养皿倒置,是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发,倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后,落入培养基的表面并且扩散,菌落中的细菌也会随水扩散,菌落相互影响,很难再分成单菌落,达不到分离的目的。4.细菌扩大培养要用LB液体培养基(通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业),划线分离要用LB固体培养基(常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存)。我们在利用微生物时,常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此,在培养微生物时必须进行无菌操作无菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的,如各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头(或称“枪头”、“tip”)、移液管、三角刮刀、接种环、镊子等等。这些用具通常用高压蒸汽灭菌法前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好。培养皿可几个包在一起;试管加棉花塞或塑料盖后也是几个包在一起;三角瓶可用封口膜(市售产品,既通气又不使菌进入)或6层纱布封口,再用牛皮纸或报纸封口;移液管上端用镊子放入少量棉花,再用牛皮纸包上(现在多不用移液管而用取样器);取样器的“枪头”放在可灭菌的专用塑料盒中,也可放在上口用牛皮纸包好的烧杯中……在121℃(1kg/cm2压力)下灭菌15min。值得注意的是,实验中所需的棉花不能用脱脂棉,因脱脂棉易吸水,吸水后容易引起污染。灭菌后,通常将实验用具放入60~80℃的烘箱中烘干,以除去灭菌时的水分。在进行实验操作前,将需要使用的用具从烘箱中取出,放到超净台上(没有超净台时,可制作一个双手在内操作、又可在外观看、并有紫外灯灭菌的箱子),然后打开紫外灯和过滤风,灭菌30min。除了实验用具必须无菌外,各种培养基也必须是无菌的。培养基是微生物生存的环境和营养物质。“细菌喜荤,霉菌喜素”,通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制,还要加入一定量的氯化钠,以维持一定的渗透压;霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。此外,细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,霉菌要求在中性偏酸的环境中生长,因此,在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。加入培养基的三角瓶、试管也要在121℃下灭菌15min,如果培养基中有葡萄糖,为防止葡萄糖分解碳化,要用500g/cm2压力(90℃以上)灭菌30min。有些不能加热灭菌的化合物,如尿素(加热会分解等,只能用G6玻璃砂漏斗过滤,但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。玻璃砂漏斗有6种,即G1~G6,G6孔径最小,细菌不能滤过。玻璃砂漏斗用后需用1molL的HCL浸泡,并抽滤去酸再用蒸馏水洗至洗出液呈中性,干燥后保存。在将培养基加到三角瓶、试管和培养皿中时,三角瓶口、试管口、培养皿壁上不能沾有培养基,否则容易发生污染。因此,在将培养基转移到三角瓶和试管中时必须用三角漏斗;向培养皿中转移已灭菌的培养基时,也不要沾在壁上。用棉花制作三角瓶和试管的塞子时,通常将棉花摊成一圆片,再裹到一适当直径的木头(或筷子)上。放入三角瓶或试管口中后,周围没有皱褶和缝隙容易拔出,但用手提着棉塞时,三角瓶或试管又不能落下。塞子制作的好坏是控制污染发生的关键。如果有条件,可以用封口膜代替棉塞。干热灭菌:160℃~170℃。尽管培养基的配方各不相同,但其基本成分都一样(五类)。人及动物的营养物质:水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类；微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。4.无菌技术（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。要注意以下几个方面:①对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌③为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(2)消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法,还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌法。5.培养基(1)培养基可分为液体培养基和固体培养基(按照物理性质)。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。（2)各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求(根据微生物的需求提供有氧或无氧环境)、特殊营养物质等碳源:能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源;糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源:能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO2、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。（3）培养基配制的原则:目的要明确、pH值要适宜、营养要协调和要经济节约。该实验步骤1.培养基的配置与灭菌：在两个250mL的三角瓶中分别装入50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基(刚配好,尚未凝固),加上封口膜。将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min。如使用高压锅灭菌,则有压力后开始计时灭菌15min。2.倒平板：灭菌后，待高压锅或灭菌锅压力与大气压相同时（即没有压力了）打开锅盖。将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上,打开超净台的紫外灯和过滤风(注意:打开紫外灯后人必须离开),待固体培养基冷却到60℃时(手放上还有些热的时候),关闭紫外灯,点燃酒精灯,用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面,并用酒精棉球擦手。在酒精灯火焰旁,以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜,右手其他3个手指拿着三角瓶;左手拿着培养皿并打开上盖的一边,将三角瓶中的培养基(10~12mL)倒在培养皿里。将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上,并轻轻晃动,使培养基铺满底部,待凝固后即形成平面。3.大肠杆菌的扩大培养：将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶放在左手中,靠近酒精灯火焰；右手拿着接种环,并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。将接种环在火焰上烧红再深入到斜面。接种前,应先使接种环接触培养基以达到冷却的目的,然后再取菌体。将菌体放入三角瓶的液体培养基中,将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在37℃,每分钟200转的摇床上振荡培养12h。4.划线分离。在酒精灯火焰上灼烧接种环，在摇床上培养了12h的菌液(由教师代做)打开,接种环部分深入到菌液中。然后,在固体培养基的平板上连续划线,接种环只在菌液中蘸菌液一次,划线后盖好培养皿。最后,将培养皿倒置(盖在下面),在37℃恒温培养箱中培养12~24h后,可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落,表明菌已被分离。5.培养保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出,再用划线法接种在斜面上,37℃培养24h后,置于4℃冰箱中保存。实验二分离以尿素为氮源的微生物一、实验原理脲酶(NH2)2C=O+H2O2NH3+CO2二.实验目的1.使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶)2.通过指示剂(酚红)颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应)三、材料1.在100mL烧杯中装入50mL70%酒精,将玻璃刮刀浸泡在其中。2.在100mL三角瓶中配制好25mL全营养LB固体培养基(0.25g蛋白胨,0.12g酵母提取物,0.25gNaCL和0.5g琼脂糖,水25mL),加上封口膜后灭菌待用。3.在100mL三角瓶中配制好25mL尿素固体培养基(0.025g葡萄糖,0.12gNaCL,0.12gK2HPO4,0.25mg酚红和0.5g琼脂糖,水15mL),加上封口膜后灭菌，待冷却至60℃时,加入通过G6玻璃漏斗过滤(使之无菌)的10mL尿素溶液(内含2g脲),摇动,混合均匀后待用。4.将盛有4.5mL蒸馏水的5支有塞试管灭菌后待用。5.在250mL三角瓶中装入99mL蒸馏水,用封口膜盖上,灭菌后待用。6.土样1g(从有哺乳动物排泄物的地方取得)。四、实验步骤1.制备无菌的LB固体培养基和尿素固体培养基:在60℃左右时,将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,在水平的超净台上摇匀,平放至凝固。2.倒平板3.制备一定浓度梯度的细菌悬液；在无菌条件下，1g土样+99m1无菌水,振荡10min,为10-2稀释液,依次制备10-3、10-4、10-5的土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。4.用涂布分离法分离细菌：取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL,分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中,再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上,待刮刀上火焰熄灭,在酒精灯火焰旁打开培养皿,将菌液涂布到整个平面上。5.培养观察：a)将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。观察菌落数。b)全营养培养基中有较多的菌落,而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。Q:本实验分离出来的细菌一定都是以尿素为氮源的细菌吗?不一定,有些细菌能利用其它微生物的代谢产物。实验4果汁中的果胶和果胶酶1.果胶是植物细胞壁的主要成分，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。山楂的果实中果胶含量最多,煮沸的山楂泥可制成山楂糕,就是由于果胶的作用。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用,去掉果胶,就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇,这是鉴别果胶的一种简易方法。用95%的乙醇。2.果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶，与制取果汁有关。有些微生物如黑曲霉，苹果青霉都可用于生产果胶酶。除去果胶有利于果汁的形成，提高出汁率和果汁变澄清。一、材料1.山楂或苹果,每组10g2.黑曲霉提取液或果胶酶溶液。3.95%的乙醇。二、步骤1.用小刀除去苹果或山楂果实中带种子的部分,并切成块,由教师用匀浆机加入少量水制成匀浆。2.取两个1