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单分子荧光检测与荧光相关光谱分子发光分析分子发光分析主要内容：荧光相关光谱在单分子检测中的应用单分子荧光检测荧光相关光谱分子发光分析概述概念：单分子荧光检测是检测灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术的总称。已经达到了分子检测灵敏度的极限。它能对单个分子进行检测和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功能之间的信息。其检测的空间尺度能达到纳米数量级。分子发光分析概述1.单分子检测的理论意义:通常对大量分子集合体的观察测量只能反映分子的平均效应，这种平均效应掩盖了许多特殊的信息；而这些特殊的信息在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构式显得尤为重要。体系中各个分子的变化过程与时间密切相关，单分子检测可以对体系中的单个分子进行研究；单分子的特征对局部场的存在非常敏感，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子的特殊位置和行为。采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波动行为或不确定行为。分子发光分析概述2.单分子荧光的产生原理：荧光的产生原理可以用右图来描述：S0、S1、S2分别表示分子基态、第一和第二激发单重态。T1为激发三重态，分子吸收光子后，被激发到S1、S2较高的能级之后，迅速弛豫到S1的最低震动能级，然后发射一个荧光光子，同时使分子回到S0的较高激发态，并弛豫迅速到S0的最低震动能级。分子便处于新一轮的激发和发射循环。分子发光分析概述根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单个分子仍可被检测到数千光子信号。检出限约为10-13mol/L分子发光分析概述3.两个基本要求：在被照射的体积中只有一个分子与光子发生相互作用，可以通过调整体系的浓度或密度来实现。单分子的新号要大于背景的干扰信号，要减少拉曼散射、瑞利散射及其它杂质荧光造成的干扰。缩小探测体积能有效减少背景干扰。分子发光分析概述4.单分子荧光的特征：量子跳跃发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的典型特征，取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光光谱和荧光强度涨落现象的原因。荧光偏振单分子荧光分子具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，分子只吸收偏正方向与其偶极矩方向一致的光子。因此在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以确定单个荧光分子的空间取向。分子发光分析23.1单分子的可检测能力影响分子检测能力的因素：由于样品中杂质产生的背景干扰；溶剂杂质荧光产生的背景干扰；分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；提高分子检测能力的方法：单分子信号与探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升)、或fL（飞升）级探测体积；结合光谱滤波和时间分辨等技术。23.1单分子的可检测能力分子发光分析罗丹明6G是单分子检测常用的一种荧光染料，右图显示了罗丹明6G的发射光谱和溶剂乙二醇的拉曼光谱图。相对于单个罗丹明6G分子的水的拉曼散射强度分子发光分析23.2全内反射和共聚焦光学系统23.2.1全内反射（TIR）分子发光分析23.2全内反射和共聚焦光学系统23.2.2共聚焦光学检测系统通过物镜照明的方法叫落射照明；入射光能激发照射锥里面所有的荧光团；发射光通过物镜被回收，称为荧光配置；散射光被双色向滤光镜分离出来；双色向滤光镜是一种能透过一些波长的光，二反射其他波长的光的装置。共聚焦光学检测原理检测器激发光发射光滤光镜分子发光分析23.3SMD光学装置几乎所有的单分子荧光检测器都使用光学装置限制观察体积。在宽视场检测和逐点检测中用到了不同的方法。在宽视场检测中最常用的是全内反射，右图是两种常用的宽视场检测方法。两种方法都是基于倒置显微镜。使用第一种方法是要使入射光瞄准物镜的焦点。棱镜物镜滤光器电感耦合摄像机更直接更方便绿色荧光蛋白图像分子发光分析23.3SMD光学装置另一种限制检测体积的方法是共焦光学和逐点检测，其所用的是一种光子探测器（SPAD），其原理如右图所示。单点检测器的存在，使样品不直接成像。一个时间点之观察一个点。光纤单分子荧光蛋白共焦荧光图像分子发光分析23.4SMD检测设备23.4.1用于单分子检测的检测器SPAD（光子探测器）——单分子单点测量优选检测器，有以下优点：SPAD连同单光子计数电子设备，只需一个5伏的电源即可工作；量子效率更高，能达到60%~90%；背景计数率低，能见效背景干扰；CCD（电感耦合检测器）——用于单分子成像由一个像素阵列构成，每个像素点都是一个独立的检测器；CCD不是光子计数探测器，而是一种集成探测器，每个像素点的信号正比于入射光子的数量；像素点的噪音不会随时间二增加，且有较高的量子效率。分子发光分析23.4SMD检测设备23.4.2SMD滤波器在单分子检测中，除去激发波长处的散射光的影响是非常必要的。根据原理的的不同可以分为全息陷波滤波器和梳状陷波滤波器。全息陷波滤波器吸收光谱图分子发光分析23.4SMD检测设备23.4.2SMD滤波器在532nm的激发光下，选用不同的滤光器检测尼罗红得到的光谱图。陷波滤波器、长波通滤波器、双色向滤波器。通过特定的发射滤波器是尼罗红的荧光强度明显减弱。分子发光分析23.5单分子光物理性质的研究在高光照条件下检测室会发生荧光闪烁现象，这种单一荧光团的闪烁可以简单的光物理模型进行解释，荧光团闪烁的主要来源是系统的交叉三重态。如果背景信号来自自发荧光，那么入射强度的增强不会引起信噪比的增加。在开始时，随着如射强度的增加，光子计数率呈直线增加，并很快达到最大值。四甲基罗丹明标记的脂质分子的光子计数率分子发光分析23.6单分子荧光检测的生化应用23.6.1单分子酶动力学单分子酶催化反应示意图用荧光标记的酶分子或底物反应，在反应过程中会发生酶的构型变化，使绿色荧光的量子产率增加，引起绿色荧光强度的增加；通过检测反应过程中荧光强度的变化，对酶促反应进行实时监测，从而获得与酶促反应有关的丰富的动力学数据。底物分子酶分子分子发光分析23.6单分子荧光检测的生化应用23.6.2单分子ATP酶活性研究肌球蛋白的S1亚基通过白蛋白-生物素-卵蛋白涂层结合到玻璃表面，在S1片段上有一个ATP酶活性，能切割Cy3标记的ATP。蛋白质也有Cy3标记，使得单一酶分子位于滑道上，ATP酶标签定位后，绑定在S1片段上的Cy3被光漂白，以消除其散射光的影响。当Cy3-ATP/ADP酶固定化之后，会发生荧光强度的瞬时增加。分子发光分析23.7单分子荧光检测的其他应用A.单分子荧光寿命估算B.单分子取向成像C.单分子取向和旋转运动D.单分子共振能量转移G.偶极辐射成像荧光单分子检测的应用领域由于单分子检测具有快速、选择性强、纳米级分辨率、检测限低、可进行实时监测等特点而在生物化学、医学、生命科学物理等领域得到了广泛的应用。E.时间分辨单分子研究H.单分子传感器F.分子马达F.分子信标分子发光分析