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第二章菌种选育第一节菌种的分离与筛选样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定1、用于大规模工业生产的菌种要求(1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长并生成所需代谢产物产量高的菌株；(2)可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，如糖浓度、温度、pH值、溶解氧、渗透压，且所需酶活性高；(3)生长迅速、代谢速度快；(4)根据代谢控制的要求可以选择野生菌株，也可以选择单产高的营养缺陷型突变株或条件突变株；(5)选择抗噬菌体能力强菌株，不易受噬菌体感染；(6)菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；(7)菌种为非病原菌，不产生任何有害的生物活性物质或毒素，包括抗生素、激素和毒素，以保证产品安全。2、分离与筛选的设计要求•菌的营养特征•菌的生长温度应选择高于40℃的菌种•菌对所采用的设备和生产过程的适应性•菌的稳定性•菌的产物得率和产物在培养液中的浓度•容易从培养液中回收产物•定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。•采样：有针对性地采集样品。•增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。•分离：利用分离技术得到纯种。•发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。3、新种分离与筛选的步骤典型的微生物采样和筛选方法（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。从自然界筛选•采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。•水样采集方法：用于细菌检测的水样应收集于100ml干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。（二）增殖培养•为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。•例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下一阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）培养分离•尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。•分离微生物的培养基要因微生物不同而定，必要时还要加入一些选择性的抑制剂，如抗生素、酚、孟加拉红等，抑制不需要的微生物的生长。一般来讲，霉菌多采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基；酵母菌用麦芽汁培养基；细菌则多用牛肉膏蛋白胨培养基。（四）纯化、筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得到适合于工业生产用的菌种。筛选有初筛和复筛。初筛初筛一般在培养皿固体培养基平板上进行。在培养皿上接种所分离的微生物，经过培养观察其生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈等的大小，进行初步测定。例如筛选柠檬酸产生菌时，可以把分离并经鉴定的宁佐美曲霉接种到含有溴甲酚绿的淀粉培养基上，经培养后，根据菌落周围变成黄色的圈的范围可以初步确定是否有柠檬酸生成。再例如，筛选某种抗生素的产生菌，就用这种抗生素的敏感菌加入到培养这种候选菌的培养基中制成平板，接种候选菌种并培养，如果条件合适，敏感菌和候选菌种均能生长的情况下，平板上如果出现抑菌圈，就说明这种候选菌是这种抗生素的产生菌。在谷氨酸生产菌的筛选中，有人先把要测定的菌种点种在培养平板上（培养基中不能含有任何氨基酸或蛋白胨一类有机氮源），经过培养再将单菌落逐个地用打孔器移放到滤纸上，待一定时间，培养基中的水分扩大到一定的直径后，去掉培养基，让滤纸干燥，再喷上茚三酮试剂显色，根据显色圈的有无和大小就可知道测定的菌种是不是谷氨酸产生菌。复筛•复筛是对初筛所得微生物再做进一步精细地测定。测定的方法可根据筛选微生物和实验目的而不同，有固体培养法、液体培养法。•应和生产发酵的条件比较接近，所筛选的微生物较适合于生产扩大培养，所测得数据具有实用意义。培养分离中要解决的问题1、分离什么和从哪里分离出?2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节微生物选育一、自然选育•自然选育是微生物菌种选育的手段之一，也是菌种选育的经典方法。它是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。（一）菌种退化变异的原因（1）遗传基因型的分离（2）自发变异的产生自发变异是不定向的，多数为负向变异。其结果是目的代谢物产量下降，生长速度变弱变慢、孢子形成能力低下等。造成变异的原因是多方面的，如长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因也可能诱发自然突变等。这是一个缓慢渐变的过程。（3）人工诱变导致的退化变异菌种退化的鉴别①单位容积发酵醪液的目的产物的单位；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的镜检形态和主要遗传特性如形成孢子能力；④发酵过程的pH变动情况；⑤醪液气味、色泽。（二）自然选育的方法•自然选育的原理是把微生物群体分离。其方法比较简单，尤其是单细胞细菌和产孢子的微生物，只需将它们制备成悬液，选择合适的稀释度，就能达到分离目的。而那些不产孢子的多细胞微生物（许多是异核的），则需要用原生质体再生法进行分离纯化。自然选育分以下几步进行。1．通过表现形态来淘汰不良菌株从菌落形态包括菌落大小、生长速度、颜色、孢子形成等可直接观察到的形态特征，来加以分析判断。此方法用于那些特征明显的微生物，如丝状真菌、放线菌及部分细菌。以抗生素菌种选育为例：一般低产菌的菌落不产生菌丝，菌落多光秃型；生长缓慢，菌落过小，产孢子少；孢子生长及孢子颜色不均匀，产生白斑、秃斑或角变。或生长过于旺盛，菌落大，孢子过于丰富等。这类菌落中也可能包含着高产型菌，但由于表现出严重的混杂，其后代容易分离和不稳定，也不宜于作保存菌种；而判断高产菌落则根据：孢子生长有减弱趋势，菌落中等大小，菌落偏小但孢子生长丰富，孢子颜色有变浅趋势，菌落表面沟纹整齐，多、密且较直；分泌色素或逐渐加深或逐渐变浅。2．通过目的代谢物产量的考察•在第一步初筛的基础上，对选出的高产菌落进行复筛，进一步淘汰不良菌株，复筛通过摇瓶培养（如系厌氧微生物，则通过厌氧液体培养基静置培养）进行，复筛可以考察出菌种生产能力的稳定性和传代稳定性，一般复筛的条件已较接近于发酵生产工艺。经过复筛的菌种，在生产中可表现出相近的产量水平。复筛出的菌种应及时进行保藏，避免过多传代而造成新的退化。3．进行遗传基因型纯度试验，考察菌种的纯度•其方法是将复筛后得到的高产菌种进行分离，再次通过表观形态进行考察，分离后的菌落类型愈少，则表示纯度愈高，相似的主要菌落（主型）占90％以上，表明其遗传基因型分离少而较稳定。4．传代的稳定性试验在生产中根据生产规模需要逐级扩大菌种，必然要经过多次传代，这就要求菌种具有稳定的遗传性。在试验中一般需要进行斜面传代3-5次（即3-5代）的连续传代，产量仍保持稳定的菌种方能用于生产。在传代试验中，要注意试验条件的一致性，以便能正确反映各代间生产能力的差异。二、诱变育种诱变育种是指人为地、有意识地将对象生物体置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。其优点是大大提高了菌种发生突变的频率和变异幅度。加快了菌种选育的速度，大大提高了获得优良菌株的机率。效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500～850～850～8000～2万～5万5～10万从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验诱变育种的步骤：原始菌种纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分离移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率观察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定（一）若干诱变剂的作用机制及诱变功能诱变因素在DNA上的初级效应遗传效应碱基类似物掺入作用AT=GC双向转换羟胺与胞嘧啶起反应GC→AT的转换亚硝酸A、G、C的氧化脱氨作用AT=GC双向转换交联缺失烷化剂烷化碱基（主要是G）AT=GC双向转换烷化磷酸基团AT→TA的颠换丧失烷化的嘌呤GC→CG的颠换糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类碱基之间的相互作用（双链变形）码组移动（＋或－）紫外线形成嘧啶的水合物GC→AT转换形成嘧啶的二聚体码组移动（＋或－）交联电离辐射碱基的羟基化和降解AT=GC双向转换DNA降解码组移动（＋或－）糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丧失嘌呤加热C脱氨基CG→TA转换Mu噬菌体结合到一个基因中间码组移动（二）诱变处理的基本方法1、出发菌株的选择：出发菌株———用来育种处理的起始菌株◆出发菌株应具备：①对诱变剂的敏感性高；②具有特定生产性状的能力或潜力；◆出发菌株的来源；①自然界直接分离到的野生型菌株：②历经生产考验的菌株：③已经历多次育种处理的菌株：2、制备细胞悬液要求：①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；②细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypiclag）;方法：①玻璃珠打散10-15min;②加０.3%吐温80（表面活性剂）③用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂——缓冲液浓度：细菌、放线菌108个/ml霉菌、酵母菌106个/ml表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。产生原因：①分离性迟延现象②生理性迟延现象3、诱变处理：诱变剂的作用：①提高突变的频率②扩大产量变异的幅度③使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70－80%）选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘