实验二-蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1

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实验二蛋白质含量的测定―凯氏定氮法一目的:学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理掌握蒸馏、滴定操作技术三聚氰胺C3N6H6“蛋白精”二、原理:蛋白质含N量约为16%,测出含氮量推知蛋白含量。消化:有机物与浓硫酸供热,使有机氮全部转化为无机氮---硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物,前者为催化剂,后者提高硫酸沸点。CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH32NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏吸收:浓碱使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中,硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低,指示剂变色(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑NH3+HBO2→NH4BO2(H3BO3→HBO2+H2O)滴定:标准HCl滴定,直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止,根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数),计算出样品中的总氮量。NH4BO2+HCl→HBO2+NH4Cl消化蒸馏、吸收滴定三、试剂与器材1、消化液:H2O2:H2S04:H2O=3:2:12、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物K2S04与CuS04.5H20以3:1混合3、30%氢氧化钠溶液4、2%硼酸溶液5、标准盐酸溶液(约0.01mol/L)6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成,棕色瓶贮存。酸性时为紫红色,碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、待测样品1.凯氏烧瓶2.凯氏定氮仪3.分析天平4.酸式滴定管5.烘箱6.消化炉7.容量瓶等等四、操作方法1.消化前样品处理固体样品:某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(%)。固体样品105℃烘干至恒重。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内,待降至室温后称重,按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后,称重一次,直到两次称量数值不变,即达恒重。若样品为液体(如血清等),可取一定体积样品直接消化测定。2、消化取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;1及2号瓶中各加样品0.1g,催化剂200mg,消化液5mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-----对照,以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。消化开始时应控制火力,不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力消化,直至消化液呈透明淡绿色。定容:冷却后,加蒸馏水(慢加,随加随摇)。将瓶中液体倾入50mL或100mL容量瓶,并以蒸馏水洗烧瓶数次,洗液并入容量瓶,定容。加样时应直接送人瓶底,不要沾在瓶口和瓶颈上。3、蒸馏吸收:改进型凯氏定氮仪特点:将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体,体积小,安装容易,操作简便。1)水蒸汽发生器和反应室2)冷凝器和通气室3)排水柱关键:搞清水管系统蒸馏器的洗涤1.接通冷凝水,向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜),酒精灯加热烧开。2.水的自动喷出:将蒸馏水从加样室加入反应室将酒精灯移开片刻,反应室内水自动喷出到蒸汽发生器打开蒸汽发生器出水口,放水。如此反复清洗3-5次。3.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5mL,2%硼酸溶液和1~2滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。蒸馏吸收准备:取50mL锥形瓶3个,各加入5mL硼酸溶液和1滴指示剂,溶液呈淡紫色,表面皿覆盖备用。关闭冷凝水,打开自由夹,使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下,冷凝器下端浸没在液体内。加样:移液管取3mL消化液(空白液和样品消化液分别做),加入反应室,用小量筒加NaOH溶液5mL,关闭自由夹,少量水封口。蒸馏:关闭自由夹,打开冷凝水。点燃酒精灯,蒸馏开始,锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时,蒸馏3分钟,移开锥形瓶,使冷凝器下端离开液面约1cm,继续蒸馏1分钟,取下锥形瓶,表面皿覆盖。蒸馏完毕后,应立即清洗反应室,方法如前所述。重复3次。最后将自由夹同时打开,将蒸汽发生器内的全部废水换掉,继续下一次蒸馏。4、滴定全部蒸馏完毕后,用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量,硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。注意:使用前检查酸式滴定管漏不漏?漏的话,涂凡士林滴定时一边滴一边摇,防止滴定过头!及时记录读数要求:空白液1次,样品消化液2次5、计算总氮量(%)=c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M);V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数;V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数;w为样品重量(1g)。14为氮的相对量子质量。消化液总量500ml,蒸馏时消化液用量3ml样品蛋白质含量(%)=总氮量×6.25注意事项冷凝水的开、关自由夹:中间酒精灯:加到2/3,防止燃烧中途不够蒸汽发生器中:水到瓶颈凹陷处火焰小心照看,防止反应液喷出防止烧到橡胶管冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中,防止NaOH污染空白:蒸10分钟未变色,再蒸3分钟铁架台:夹子口朝上思考题1、何谓消化?如何判断消化终点?2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么?3、固体样品为什么要烘干?4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中?5、如何证明蒸馏器洗涤干净?6、本实验应如何避免误差?

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