免疫组化

免疫组织（细胞）化学内容免疫组化免疫荧光显微镜的使用免疫组织（细胞）化学用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）技术。概念IHCICC原理根据抗原抗体反应和化学显色原理最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量酶或荧光基团分类按标记物质的种类免疫荧光法：荧光染料放射免疫法：放射性同位素免疫酶标法：HRP（辣根过氧化物酶）免疫金银法：胶体金按结合方式抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。内容免疫组化*免疫荧光显微镜的使用实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理石蜡切片：组织切片在60℃恒温箱中烘烤6-8h，浸二甲苯前应在60℃烤0.5-1h。脱蜡：组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟水化：分别过无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，自来水，双蒸水冰冻切片：将切片放在37℃烘烤1h，然后置于组化PBS或蒸馏水中浸泡预处理实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理抗原修复抗原修复(AntigenRetrieval，AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。修复介质：①0.01MpH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；②EDTApH9.0。修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃，15min；③水浴锅100℃，10/20min；④高压锅/消毒锅120℃，3min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。热处理后应注意自然冷却（至少半小时）；热处理液不要让其煮干；不要任何抗原的检测都使用该方法；同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。抗原修复实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理去除内源性过氧化物酶尤其在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响。用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别。注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%-5%，时间不宜过长，10-40min。实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理血清封闭驴血清10%BSA3%triton-1000.1%tween-200.05%PBS组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物的非免疫血清(1:5~1:20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%~5%牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为室温2h，或根据说明书。封闭前封闭后实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理一抗首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号购置抗体的注意事项种属：单克隆抗体，多克隆抗体能否用于石蜡切片稀释度特异性，交叉反应用何种组织前处理形式（如抗原修复形式等）包装单位，价格孵育浓度：首先不同的稀释度摸条件，如1︰50、1︰100、1︰200等。选择合适的稀释度完成后续实验。（选择表达较高的组织进行此步实验）孵育时间：可先选择短时间如2h，若结果不理想，则适当延长时间。但确定后不要更改。孵育温度：室温为宜（25℃左右），如过夜则置于4℃孵育，加二抗前复温至少0.5h。37℃孵育可能会使染色过强，或产生非特异性着色。一抗对照阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做。用于排除方法和实验系统有无问题；阴性对照一般是用PBS替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。用于排除有无一抗外的非特异性染色。实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理二抗PV即用型SP生物素放大PV9000：鼠、兔通用PV9003：羊来源一抗SP9000：鼠、兔通用SP9003：羊来源一抗实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理DAB显色DAB试剂盒：浓缩液：稀释液=1：20量取50mLPBS置于有毒区棕色瓶，再称取DAB粉末0.02g溶于PBS，振荡混合，避光过滤到专用玻片缸中，加入200μLH2O2摇晃均匀，即可开始显色。根据显微镜下观察的结果终止染色，记录显色时间。注意：1.粉末DAB显色阳性信号可能会在显色1-2min时才出现，请勿过早终止。2.DAB的有效作用时间为半小时，如果超过15min未产生阳性信号，则可以提高一抗浓度或延长一抗孵育时间。3.同一分子在不同处理组的显色时间要保证一致。4.DAB为一次性试剂，用后自觉将液体倒掉，并将玻片缸放于固定位置。5.DAB粉末放于有毒冰箱-20度，用后放回原处。实验步骤石蜡切片脱蜡、水化冰冻切片ddH2O或PBS洗抗原修复3%H2O2孵育10min去除内源性过氧化物酶即用型二步法ABC放大法血清封闭（试剂A）室温2h孵育一抗孵一抗孵二抗试剂137度20分钟孵生物素偶联二抗（试剂B）室温2h孵二抗试剂237度30分钟孵ABC液（试剂C）37度40分钟DAB显色复染封片脱水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯预处理苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗5分钟脱水、透明、封片、镜检。脱水：70%酒精3分钟，80%酒精3分钟，95%酒精5分钟，无水乙醇5分钟，拿出晾干。透明：二甲苯各8分钟封片：中性树脂镜检原则必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激酶CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。结果判定尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。一、阳性标记免疫特征：分弱(+)、中(++)、强(+++)三级。免疫酶标记（HRP-DAB/H2O2）表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。++++++二、阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。四、阳性标记强度特征依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性（+++，指阳性细胞总数在50%以上)。此外，还有++++，指阳性细胞总数在75%以上)。IS染色结果=染色强度×阳性细胞百分比。结果为0-12分，其中0-3分为低表达组，4-12分为高表达组。只有一种评判标准，具体的可参考文献。平均值：随机选择5个高倍视野，计数1000~2000个细胞，取其平均值为该病例的细胞表达率，高于均值为高表达，低于为低表达统计软件统计是否差异有统计学意义SPSS/state注意事项二甲苯在烘箱中加热时必须将鼓风关掉，防止二甲苯挥发溢出。切片放入二甲苯及换缸时必须在通风橱中进行，然后再拿到烤箱中。夏季二甲苯可不加热。烤箱温度不要超过62度抗原修复后，切片不能直接放到冷水中，要在修复液中冷却到室温。抗原修复后一定不要干片，尤其是涂唇膏或指甲油的过程中，否则易产生非特异性着色。DAB显色后直接将切片放入自来水中，以免弄到湿盒内造成污染。做好个人防护。二甲苯更换时直接倒在通风橱内的空瓶子中，可用卷纸将缸内蜡渍擦净，然后倒入新的二甲苯。脱蜡和透明的二甲苯不能混用。通风橱两侧的二甲苯及梯度酒精不能混用左侧脱蜡右侧透明封片脱水时从无水乙醇中拿出后必须晾干，才能放入二甲苯中。而在二甲