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研发背景分子基础以及构建安全及有效性评价前景展望巴斯夫旗下诺尔药业英国剑桥抗体技术公司CAT噬菌体展示技术→筛选得到某一特定抗原表位的TNF抗体→人源化加工处理→得到第一个完全人源化抗TNF-α单抗药物D2E7Ⅱ期临床试验证明有疗效继续研发、建立营销渠道需要很大投入巴斯夫回归化学主业剥离诺尔药业2000年，雅培以69亿美元收购诺尔药业及其所有上市和在研产品。1993年2003年1月首次在美国上市，美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗中到重度类风湿关节炎雅培耗资10亿美元以扩展该药的新适应症：银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、斑块型银屑病、多关节型幼年特发性关节炎2012.10，美国FDA批准了该药的第七个适应症:溃疡性结肠炎。这使得修美乐将在慢性病领域发挥作用，并影响美国的62万患者。修美乐在溃疡性结肠炎这一领域的使用，为其增加额外的5亿甚至更多的销售额。修美乐可以预见适应症还将继续拓宽，2015年已经分别向FDA和欧洲药管局（EMA）提交了该药物用于化脓性汗腺炎的新药上市申请。2012年起，修美乐就以94.8亿的成绩稳坐全球药物销售排行榜榜首。2015年的销售额更是达到了140.9亿元。新药层出不穷，修美乐能够荣登全球畅销药之首的主要原因是：产品过硬、适应症广、受众群大，能解决临床上的迫切需求。2013年，雅培宣布进行拆分，修美乐被划归为专注于生物制药研发的新公司艾伯维旗下全人源抗体制备的四种途径:一.从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb。二.用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb。全人源抗体制备的四种途径:三.通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。四.通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，阿达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，κ链恒定区序列，包括1330氨基酸残基，分子量大概有148kD。该抗体对hTNF-α具有很高的亲和性（Kd=10-8Morless）和比较低的解离速率（Koff=10-3/sorless)，阻止其与细胞表面的TNF受体p55，p75位点结合，能够使体内表面TNF表达的细胞裂解，导致TNF水平降低。能够中和hTNF-α的活性包括hTNF-α诱导的细胞毒性和细胞活化作用。关于D2E7的结合特异性，其可与各种形式的hTNFα结合，包括可溶性hTNFα，跨膜hTNFα和与细胞受体连接的hTNFα。D2E7不会与其它细胞因子特异性结合。轻链可变区序列D2E7的一级结构重链可变区序列重组人源抗体的筛选1.建立人源scFV噬菌体抗体库。其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的mRNA经噬菌体展示技术得到的。2.为了分离与hTNFα具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对hTNFα具有高亲和力的鼠源抗体（MAK195）用抗原表位印记（epitopeimprinting)的方法选择对hTNFα具有亲和力的人源序列。3.选好了VH和VL片段之后，“mixandmatch”实验用来筛选合适的VH和VL配对。4.获得编码合适抗体的DNA序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达。获取编码抗体轻链和重链可变区的DNA片段经突变后编码D2E7或者D2E7相近抗体的氨基酸序列。通过重组DNA技术进行下一步操作表达载体的构建人源序列的突变通过标准方法获取。例如:PCR介导的突变（即通过引物使突变的核苷酸插入）或者定点突变抗体的表达这可通过PCR对人源轻链和重链的修饰和扩增获得。例如为了获得D2E7或与其相近抗体的编码重链可变区的DNA片段，人VH基因的VH3基因家族中某一基因（DP-31)通过PCR进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人VL基因的VκI家族中的某一基因（A20）通过PCR进行扩增。例如把可变区序列转变为完整的抗体，Fab或者scFV片段。即把轻重链可变区序列分别与其对应的恒定区结合，重链恒定区可以是IgG1-4、IgA、IgD、IgM和IgE，最好是IgG1和IgG4的恒定区。轻链恒定区可以是κ和λ链恒定区，最好是κ链恒定区。为了表达D2E7，抗体的轻链基因和重链基因可以插入到不同的载体，但最好插入到同一载体。D2E7或者其相关的轻链和重链基因在连接到载体之前，载体上可能已经携带抗体恒定区序列。另外，重组表达载体可以编码一个信号肽，从而有利于抗体从宿主细胞的分泌。除了抗体链基因，重组表达载体携带了可调控抗体链基因在宿主细胞表达的调控序列。调控序列包括启动子，增强子和其它表达控制元件。除了抗体链基因和调控序列，该重组表达载体还可以携带其他序列，如调控载体复制的序列和选择标记基因。对于哺乳动物的宿主细胞表达更倾向于使用病毒元件，从而有利于其在哺乳动物细胞中的高效表达。例如来自巨细胞病毒（CMV），猴病毒40（SV40)，腺病毒，多瘤病毒等的启动子和增强子把携带有抗体轻链和重链基因的载体转染到宿主细胞中去：尽管在理论上其在真核和原核细胞中都能表达，在真核细胞尤其是哺乳动物细胞中表达是最好的方式。表达重组抗体的细胞倾向于使用CHO细胞（包括dhfr-CHO细胞，含有DHFR选择性标记），NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。重组表达载体转入宿主细胞后经过一段时间的表达，表达后的抗体分泌到培养基上。然后利用蛋白质纯化的方法收集抗体。宿主细胞也可以用来产生不完整的抗体，如Fab或者scFV分子。研发过程试验了各种形式的抗体，重组DNA技术可以用来排除不能结合hTNFα的抗体。对于抗体或者其抗原结合部位的表达最倾向于使用载有编码抗体重链和轻链的基因的重组表达载体通过磷酸钙转染法转入到dfhr-CHO细胞中。重组表达载体中，轻链和重链基因连接到CMV增强子和AdMLP（腺病毒）启动子以增强其高水平表达。重组表达载体携带有DHFR标记基因，可用甲氨蝶呤进行选择。最后培养宿主细胞进行抗体的表达，并从培养基中收集到抗体。不良反应常见不良反应有抗核抗体(ANA)转阳性(12%)、产生低滴度的D2E7抗体(5%)、注射部位反应(12%)、头痛(12%)、高血压(5%)等。严重不良反应有严重感染、恶性肿瘤和淋巴瘤及神经系统反应。严重感染主要为上呼吸道感染、尿路感染和支气管炎等,发生率为每年100人中0.04人。恶性肿瘤和淋巴瘤的标准化发生率(SIR)(实际观察发病人数/预期发病人数)分别为1.0和5.4。神经系统反应主要为脱髓鞘作用,出现皮肤感觉异常。有效性271例患者参加的一项随机、双盲、安慰剂对照的试验,为期24周,患者被随机分为4组,分别接受D2E720,40,80mg及安慰剂皮下注射,每2周1次,同时服用MTX（甲氨蝶呤）,剂量不变。第24周时采用ACR制定的20%,50%,70%改善标准(ACR20,ACR50,ACR70)评价疗效。结果显示,在治疗第24周,D2E7加MTX组患者ACR20改善率分别为47.8%、67.2%和65.8%,显著高于安慰剂加MTX组;D2E7治疗组ACR50改善率分别为31.9%,55.2%和42.5%,亦显著高于安慰剂组;D2E7的40,80mg治疗组ACR70改善率为26.9%和19.2%,也显著高于安慰剂对照组。目前，我国与国外的技术还有比较大的差距。全人源抗体的构建与动物细胞大规模培养技术是限制我国单抗药物的瓶颈，应加大力度攻克技术难关。我国的生物制药公司应尽快加紧对修美乐等仿制药物的研发，这不仅能给自己的公司带来一大笔利润，更能造福我国的类风湿关节炎等自身免疫性疾病患者。1.JochenG,Salfeld,NorthGraftonet.al.HumanantibodythatbindhumanTNFα.UnitedStatesPatentNO.6090382.1996.2.谢玉婷,汪年松.阿达木单抗在类风湿关节炎治疗中的应用[J].世界临床药物,2012,33(2):65-69.3.丁俊杰,李中东,王宏图.治疗类风湿关节炎新药—全人源α-肿瘤坏死因子单克隆抗体[J].中国药学杂志,2005,40(2):157-158.4.冯晓,张洁涵,李福军,等.抗TNFα的全人源单克隆抗体及其应用:中国,CN104892760A.2014.5.WeinblattME,KeystoneEC,FurstDE,et.al.Adalimumab,afullyhumananti-tumornecrosisfactoralphamonoclonalantibody,forthetreatmentofrheumatoidarthritisinpatientstakingconcomitantmethotrexate:theARMADAtrial.ArthritisRheum2003,48:35-45.