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RNA药学1201班1组基本内容1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳基本内容1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳RNARNA概论常见提取方法技术应用DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA是遗传信息的主要载体，蛋白质是生命的物质基础，在DNA和蛋白质之间,RNA起着中介作用。与DNA相比,RNA种类较多,分子量相对较小,在遗传信息表达和调控过程中各类RNA分别发挥作用。这是我们对RNA的基本知识。下面图示为中心法则：1、人类细胞质RNA的提取RNA概论rRNA基因组RNAmRNA样非编码RNA小胞质RNA小核RNA核仁小RNA端粒酶RNA反义RNAtmRNAGuideRNA核酶RNAtRNAmRNARNA信使RNA(mRNA)携带从DNA转录来的遗传信息转运RNA(tRNA)负责蛋白质合成时氨基酸的转运核糖体RNA(rRNA)在核糖体中起装配和催化作用具有催化作用的RNA即核酶RNA和其它RNA的自我催化分子基因组RNA指一些病毒以RNA为遗传物质指导RNAmRNA样非编码RNA其转录和加工方式同mRNA,但不翻译为蛋白质tmRNA本身既是mRNA又是tRNA,翻译时一身二任，如大肠杆菌中的10SaRNA小胞质RNA存在于细胞质中的小RNA分子，如信号识别颗粒小核RNA是剪接体的组分是指导RNA编辑的小RNA分子核仁小RNA参与rRNA的加工端粒酶RNA是真核生物端粒的模板反义RNA可通过与靶位序列互补而与之结合的RNA,或直接阻止靶位序列功能，或改变靶部位构象而影响其功能。1、人类细胞质RNA的提取常见提取方法异硫氰酸胍一步法提取RNA异硫氰酸胍氯化铯超速离心法盐酸胍－有机溶剂法氯化锂－尿素法1）异硫氰酸胍一步法提取RNA主要原理异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚/氯仿抽提，使RNA与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。1）异硫氰酸胍一步法提取RNA操作流程1.100mg组织加1ml变性液冰浴匀浆。2.将匀浆液移人5mlEppendorf管内，加0.1ml2mol/L乙酸钠pH4.0，颠倒混匀，加1ml水饱和酚，彻底混匀，加0.2ml49:1氯仿／异戊醇，彻底混匀，0－4℃培育15min。3.于4℃以10000r／min离心20min，移上清水相到另一管。4.加lml100％异戊醇沉淀RNA－20℃30min，于4℃以10000r／min离心10min，弃上清液。5.溶解RNA沉淀在0.3ml变性液中，移入1.5ml离心管中。6.用0.3ml100％异丙醇沉淀RNA－20℃30min，10000r／min离心10min弃上清液。7.悬RNA在75％乙醇中，振荡，室温孵育10－15min。8.10000r／min弃上清液，真空干燥5－10min。9.用DEPC水100－200ul溶解RNA样品，可存于－70℃或在乙醇中置－20℃保存。1）异硫氰酸胍一步法提取RNA注意事项1.操作时必须戴手套。2.所用的器皿和试剂均须经DEPC水处理或250－300℃干烤4h。3.DEPC致癌。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法主要原理异硫氰酸胍抑制RNA酶的活性，以CSCl为介质，进行密度梯度离心，分离RNA时，因RNA在CSCl溶液中的密度比蛋白质和DNA大，经离心后，RNA沉降到管底而DNA与蛋白质溶于上清液中，达到分离RNA的目的。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法操作流程1.加5－7倍于组织细胞体积的异硫氰酸肌匀浆液至含样品的勾浆器中。高速匀浆l－2min。2.加十二烷基肌酸钠（SLS）至终浓度0.5％，混匀，5000r／min室温离心10min。3.在Beckman离心机相应离心管中，20℃按下表超速离心。4.弃2／3GIT溶液，用吸管将下1／3吸出，用于染色体DNA的制备，管底胶状沉淀即总RNA。5.用70％乙醇洗RNA沉淀，弃乙醇，干燥。6.用300ulTEpH7.6（含0.1％SDS）溶解RNA沉淀，用等容积酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。7.上清加人0.1体积3mol/LNaAc（PH5.2），2倍体积乙醇混匀，－70℃30min。8.于4℃以12000r／min离心10min，弃上清液，70％乙醇漂洗RNA沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，真空抽干燥。9.DEPC水适量溶解RNA，测定OD260与OD280，计算RNA的质量与浓度，－20℃或加3倍体积的乙醇－70℃保存。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法注意事项1.本方法适用于一组织或108个细胞的RNA的提取，不适用于小分子(5SRNA，tRNA）的提取。2.操作过程中避免RNase的污染。3.离心温度低于4℃或离心速度太快将导致CSCI析出。3）盐酸胍－有机溶剂法主要原理利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质。3）盐酸胍－有机溶剂法操作流程1.组织样品中加10倍体积盐酸胍匀浆液Ⅰ，高速匀浆1min。2.室温5000r／min离心10min。3.取上清，加0.1倍体积3mol/LNaAc（PH5.2），混匀，加2.5体积预冷的乙醇充分混匀，0℃放置2h。4.于0℃以5000r／min离心10min，弃上清液，室温干燥。5,加人10ml－15ml盐酸胍匀浆Ⅱ，搅拌溶解。6.加人2.5体积冰预冷的乙醇，立即充分混匀，－20℃放置2h。7.4℃5000r／min离心10min，弃上清液，室温挥发乙醇。8.重复6、7两次（即总共用0.5倍体积乙醇沉淀3次）。9.按5ml/组织g加0.02mol/LEDTA（pH8.0）溶解核酸。振荡1－2min，3000r／min，离心2min取上清液。10.等体积氯仿正丁醇（4:1）抽提，5000r/min室温离心10min，取上清液。11.加3倍体积4mol/LNaAc（PH7.0）混匀，－20℃放置1h。12.于0℃以5000r／min离心20min，弃上清液。用4℃预冷的3mol／LNaAc（PH7.0）漂洗RNA沉淀，20℃5000r／min离心20min，弃上清液。13.按1ml/组织细胞(g)加0.2％SDS，0.05mol/LEDTA（PH8.0），溶解RNA。14.加2倍体积预冷乙醇混匀，0℃放置2h。于4℃以5000r／min离心10min。弃上清液70％。乙醇漂洗RNA沉淀，离心1min，奔上清液，室温干燥蒸发乙醇。15.用适量双蒸水溶解RNA沉淀，加3倍体积乙醇，－70℃保存备用。3）盐酸胍－有机溶剂法注意事项1.避免DNA污染。2.可用无Rnase的DnaseⅠ处理污染的DNA。4）氯化锂－尿素法主要原理利用高浓度尿素变性蛋白质，抑制RNA酶，选择性沉淀RNA。4）氯化锂－尿素法操作流程1.将0.5－1.0g寡聚（dT）－纤维素悬浮于0.1mol/L的NaOH溶液中。2.用1ml注射器或吸管（经DEPC水处理并高压），将寡聚（dT）－纤维素装柱0.5－1m，用3倍柱床体积的消毒水洗柱。用1×上样缓冲液洗柱，至洗出液pH＜8.0。3.将RNA溶于消毒水中，65℃加热5min冷却至室温，加等容积2×上样缓冲液，混匀上柱立即收集流出液，当RNA上样液全部进人柱床后，再用1柱床容积的1×上样缓冲液洗柱，收集流出液。将所有收集液65℃加热5min，冷却室温，上柱，收集流出液。4.用5－10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，按1ml分部收集，OD260测RNA含量。5.用2－3柱体积的洗脱缓冲液洗脱Poly（A+）RNA，分部1／3－1／2柱容积收集，OD260分别测Poly（A＋）RNA值，合并Poly（A＋）RNA。6.加1/10体积的3mol/LNaAcpH5.0混匀，再加2.5体积的预冷冰无水乙醇，混匀。－20℃沉淀RNA30min。7。于4℃以10000g离心15min，弃上清液。70％乙醇漂洗沉淀，10000r／min室温离心5min，弃上清液，室温蒸发乙醇。8。适量DEPC水溶解RNA，3倍体积的乙醇，混匀，－70℃保存。4）氯化锂－尿素法注意事项1.在无RNase环境下操作。2.比色杯用浓盐酸或甲醇（1:1）溶解浸泡1h，DEPC水反复冲洗。3.十二烷基肌酸钠盐在18℃以下溶解度下降会阻碍柱内液体流动。4.1OD260相当于40ug／mlRNA，107细胞能提取1-5ugpoly（A+)RNA，相当于上柱RNA量的1％－2％。小结以上四种方法都能将RNA从细胞质中提取出来，但是通过紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳检测发现，盐酸胍－有机溶剂法未能完全除掉DNA，异硫氰酸胍氯化铯超速离心法可活的高纯度的RNA，但是所需仪器和试剂昂贵，费时费钱，一步法提取的RNA纯度高且未被降解，简便快速，既可用于大量样本，又可用于微量组织，细胞的RNA提取。RNA的纯化方法在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而。达到纯化RNA的目的有机溶剂抽提法氯仿抽提硅基质吸附法通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，最后用RNase-freeddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来RNA提取的应用完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。2、RT-PCR技术简介RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。2、RT-PCR技术原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。2、RT-PCR技术操作流程1.从细胞或特定组织中提取总RNA；2.逆转录实验；3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。2、RT-PCR技术注意事项1、作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。2、用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。3、由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。4、RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloneymurineleukemiavrius,MMLV）反转录酶。2、RT-PCR技术主要方法实时荧光定量RT-PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。实时荧光定量RT-PCR技术操作流程1.从细胞或特定组织中提取总RNA；2.逆转录实验；3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。2、RT-PCR技术荧光标记探针水解探针模式该探针能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一3’活性所降解,探针的5’端有一荧光报告基团,3’端有一荧光淬灭基团,当2个基团相互先靠近的时候,由于发生能量传递作用,报告