第15章-聚合酶链式反应

第十五章聚合酶链式反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个ephendof管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA1、设想1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史2、PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件。3、PCR的改进与完善①Mullis最初使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。缺点是：Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加；引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。②1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，但该酶不耐高温。③1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。PCR技术得以广泛应用。1983，Mullis建立了PCR反应体系，1987获专利1987，PE-Cetus公司推出PCR自动化热循环仪1988，PE-Cetus公司获得基因工程方法生产的耐热DNA聚合酶1989，PE-Cetus公司获得PCR方法、天然Taq酶及重组Taq酶三项专利1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1988年，在PCR系统引入热稳定的TaqDNA聚合酶，多次循环后TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。第一节聚合酶链式反应扩增原理PCR是KaryMullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程，即利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。该系统能在体外将特异DNA片段一短时间内迅速扩增106以上。PCR是由引物、聚合酶、底物等组成。该反应全过程分三步：变性、退火和延伸。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。①模板DNA变性：模板DNA经93℃左右加热一定时间后，双链DNA模板解离成为单链。②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。由于加入的引物比模板DNA的分子数远远过量，故引物与模板DNA形成复合物的机率远高于DNA分子自身的复性。③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的单链。PCR循环–第一步–加热变性PCR循环-第二步–引物与靶序列退火PCR循环-第三步-引物延伸第1个PCR循环完成后得到两个拷贝的靶序列30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍通常进行聚合酶链式反应，主要考虑反映体系、反映参数和DNA变性时间与终变时间三个方面内容。（一）反应体系聚合酶链式反映体系的总体积依试验要求而定。例如，在50ul聚合酶链式反应（PCR）体系中，加入下列试剂：20pmol上游引物和20pmol下游引物，20mmol/LTris-Hcl(pH8.3,20℃)、1.5mmol/LMgCl2、25mmol/LKCl、0.05%Tween20、100ug/ml明胶或无核酸酶的牛血清蛋白、50umol/LdNTP、2UTaqDNA聚合酶、100-200ngDNA模板，将试剂混匀。（二）反应参数聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否。通常PCR反应所采取的反应参数为：变性温度95℃60s退火温度38~65℃60s延伸温度72℃1~2s循环次数30~35次复性温度决定与所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过实验来确定。（三）DNA变性时间与终延伸时间为了使模板DNA双链充分打开，开始时模板DNA变性要适当延长，一般设预变性（predenature)94℃3~5min。一般在扩增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子，都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸（postextention），时间要保持在10min左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应终止后，可以放到4℃中保存，以备电泳检测。PCR反应五要素?引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）一、反应系统1．TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。在100μlPCR反应中，1.5-2U的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。在细胞内参与DNA复制的因子有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、RNA引物、核苷酸底物、无机离子，解旋酶等，并且反应系统要调节到适宜PH值。双链DNA变性的温度为94℃，在PCR问世初期，在每一循环结束时补充新酶，1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erich分离纯化出适于PCR的热稳定性Taq聚合酶，为PCR成为实用方法奠定了基础，现已可用这因重组法生产Taq聚合酶。TaqDNA聚合酶的最适温度为75—80℃，合成速率约为150个核苷酸/s每个酶分子，即使在70℃，延伸速率亦可达60个核苷酸以上。普通PCR一般选择72℃作为延伸温度。Taq聚合酶在扩增过程中可引起错配，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。当采用低浓度的dNTP(各20umol/L)、1.5mmol/LMg2+及复性温度高于55℃时，可提高酶的专一性，降低合成的错配率。也可以使用具有3’→5’外切核酸的活性的DNA聚合酶参与反应，降低错配率。但是，3’→5’外切核酸酶会破坏引物和单链模板，在使用时，应将有3’→5’外切核酸酶活性的和无3’→5’外切核酸酶活性的酶联用，这样可使错配率降低3倍(2.5×10-5降低到8.5×10-6)。Taq聚合酶具有类似于末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt）的活性，可在新生成的双链DNA产物的3’端加上一个碱基，尤其易加dATP。因此，克隆PCR产物到载体上时，可采取两种方法：一是直接将构建的dT载体与PCR产物连接；二是先用Klenow片段将PCR产物的3端的A去掉变为平端，与平端载体连接。Taq聚合酶Taq具有反转录活性，在2-3mmol/LMg2+浓度下，68℃时出现类似反转录酶的活性，利用这一活性，可直接用于反转录PCR，尤其适合短片段的扩增。以往Taq聚合酶进行PCR扩增时，一般只能扩增小于400bP的DNA片段。经过对PCR操作、此酶的结构和功能的改进，已能扩增20kb以上的DNA分子。通常100ulPCR反应液中含1-2.5ulTaq聚合酶宜，最佳酶浓度在0.5—5u范围内确定，另外值得注意的是，尽管Taq聚合酶热稳定性较好，但保存时，温度须20℃。2．模板PCR反应的模板可以是单链分子、双链分子、线状分子或环状分子，可以是DNA，也可以是RNA。(线状分子比环状扩增的效果稍好)。当用RNA作模板时．首先要先进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。模板来源较广泛，可以从培养的细胞、细菌、病毒和组织中等提取，也可从收集的病理样品和考古标本等获得。♦模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102-105个拷贝。过多可能会增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。3．引物引物可以决定PCR扩增产物的特异性与长度。PCR有两种引物，即5’端引物与3’端引物，是一种寡核苷酸片段，分别与模板5‘端序列和3’端序列互补。引物设计的一般原则：(1)引物长度：引物不宜太短或太长，一般以16-36bP为宜，引物太短会影响PCR的特异性，引物过长会增加成本和引物的Tm值，Tm值如果超过TaqDNA聚合酶的最适延伸温度，也会明显影响产物的特异性。(2)G+C含量：引物中G+C含量一般40％—60％为宜。(3)碱基分布：4种碱基应随机分布，嘌呤或嘧啶不要有3个以上连续排列。尤其是在引物3端，否则会形成引物与核酸G(或C)富集区之间的错误互补，影响PCR的特异性。(4)引物自身不含互补序列。(5)两个引物之间的互补或同源碱基应＜4个。(6)引物与非特异性靶区之间的同源性要＜70％或者连续互补同源碱基＜8。(7)引物3’端不能错配。3’端最好是G或C，切忌A。(8)引物5’可以修饰，包括增加酶切位点、用生物素、荧光物质、地高辛等标记，以及引入突变位点、启动于序列和蛋自质结合DNA序列等。★一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。4．底物dNTP为PCR合成DNA的底物，各种dNTP浓度相同，一般浓度为20—200umol／L。5．缓冲液根据经验，一个50—100ul的标准反应系统，应包括20umol/LTris-Hcl缓冲液(PH7.5)、100mmol/LKCI、1mmol/LDTT、0.1mmol/LEDTA、0.5％Tween20和1.5mmol/LMgCl2。Tris—HCl缓冲液可稳定pH值，Kcl有利于引物退火，而DTT与Tween20，则可以保护Taq聚合酶的催化活性。在PCR反应系统中应加入Mg2+，因为Taq聚合酶活性需要Mg2+，但该离子浓度变化亦不能过低或过高，过低时酶活性降低，而过高会催化非特异性扩增，且酶活性还会受到抑制。此外，Mg2+的浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等过程。二、反应过程及条件1．变性PCR扩增循环变性的温度和时间分别为95℃、30s，或97℃、15s。提高变性温度可以使变性时间缩短，但温度过高或时间过长会破坏Taq聚合酶及dNTP。一般选择温度为94℃或95℃，时间为30—60s。2．复性变性结束后，DNA快速冷却，以便模板与引物转到复性(即退火)步骤。复性温度过高，融合率低，甚至为零。温度