RNA-Seq 测序数据分析服务流程 (试运行)

北京大学生科院/CLS生物信息平台RNA-Seq测序数据分析服务流程（试运行）2015.3平台联系人：李程（[e-mail]）文档撰写：张超TableofContents1.测序质量评估............................................................................................31.1测序数据过滤...............................................................................................31.2质量值分布..................................................................................................31.3GC含量分布................................................................................................42.参考序列比对............................................................................................43.基因表达水平............................................................................................63.1基因表达水平定量........................................................................................63.2基因表达水平分步........................................................................................63.3生物学重复相关性分析.................................................................................63.4样本间层次聚类及PCA分析.........................................................................74.差异基因分析............................................................................................74.1基因表达标准化............................................................................................74.2差异基因列表...............................................................................................84.3差异基因可视化............................................................................................84.4差异基因聚类...............................................................................................95.差异表达基因功能分析............................................................................105.1GO富集分析..............................................................................................105.2信号通路富集分析......................................................................................105.3癌基因功能注释..........................................................................................116.基因结构差异分析....................................................................................116.1可变剪切分析.............................................................................................117.SNP分析................................................................................................127.1SNP检测...................................................................................................127.2SNP筛选...................................................................................................127.3GO/KEGG富集..........................................................................................121.测序质量评估通过测序的数据进行进行质控，保证数据质量适合下游分析。这里我们使用fastqc和RNA-SeQC来对数据进行质量评定。1.1测序数据过滤测序得到的原始下机数据往往有许多问题，不能直接使用，通常会经过以下过滤，尽量保证测序数据的质量。a.去除带测序接头的测序序列（reads）；b.去除低质量的reads1.2质量值分布按照现有的测序技术（illumina平台）单碱基的错误率应控制在1%以下,即质量值在20以上。横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基质量值质量值与错误率的关系：Qphred=-10log10(e)；其中Qphred为测序碱基质量值，e为测序错误率。1.3GC含量分布对于RNA测序，鉴于序列通过超声随机打断，所以理论上每个测序循环上的C、G及A、T含量应分布相等，并且CG-content对于每个物种应大致相同。横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为各种碱基的不同比例2.参考序列比对对于通过质量控制的数据，可以进行后续分析。首先需要将cleanreads比对到参考基因组上。由于测序时reads是随机的，只有这些reads的碱基信息和质量信息，没有其在基因组上的位置信息，比对这一步就是给所有reads一个在基因组上位置的信息。在RNA测序中，其实测的是cDNA的序列，由于内含子的存在，所以会较常出现一条read跨内含子的情况，tophat2可以较好的处理这种情况，所以我们选用tophat2来做比对。比对率间接反应了测序的质量和建库的质量，若比对率低，很可能建库时混入了其他物种的序列，导致无法比对到研究的物种参考基因组上。reads比对到基因上的位置统计：SampleIntragenicRateExonicRateIntronicRateIntergenicRateSplitReadsExpressionProfilingEfficiencyTranscriptsDetectedGenesDetected1BJ0.8850.7380.1470.1149,910,0100.73832,79615,434（1）Sample：样本名（2）IntragenicRate：比对到基因内的reads比例（3）ExonicRate：比对到外显子的reads比例（4）IntronicRate：比对到内含子的reads比例（5）IntergenicRate：比对到基因间区的reads比例（6）SplitReads：比对到两外显子交接处的reads数（7）ExpressionProfilingEfficiency：比对到外显子上的reads占总体的比例（8）TranscriptsDetected：比对上reads数大于5的转录本数（9）GenesDetected：比对上reads数大于5的基因数3.基因表达水平3.1基因表达水平定量在RNA-seq分析中，我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的reads的计数来估计基因的表达水平。Reads计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性，人们引入了RPKM的概念，RPKM(ReadsPerKilobasesperMillionreads)是每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数目。RPKM同时考虑了测序深度和基因长度对reads计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法(Mortazavietal.,2008)。Gene_IDSample1Sample2Sample3Sample4Sample5Sample6ENSG0000000000349.3246.9448.9122.5120.6022.95ENSG0000000041935.9234.5833.6932.8035.6532.73ENSG000000004571.340.941.192.062.132.26ENSG000000004601.191.201.223.003.333.06(1)Gene_ID：Ensembl基因ID(2)Othercolumns：各样本中该基因的表达水平(RPKM)3.2基因表达水平分步每个样本所有基因的RPKM盒形图可以展示出不同实验条件下基因表达水平的分布情况。图3.2.1不同条件下的基因表达水平分布图3.3生物学重复相关性分析生物学重复主要有两个用途：一个是证明所涉及的生物学实验可重复性强、差异小，另一个用于估计生物学变异进行差异基因检测。样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。相关系数越接近1，表明样品之间表达模式的相似度越高。图3.3.1生物学重复散点图3.4样本间层次聚类及PCA分析当样本数目较多时，可以利用基因的表达量进行样本间聚类分析及PCA分析，对样本间关系进行探究或者对实验设计进行验证。样本聚类距离或者PCA距离越近，说明样本越相似。4.差异基因分析4.1基因表达标准化对于有生物学重复的样品，我们采用DESeq2提出的scalingfactor的方法对原始的readcount进行标准化（normalization）。以消除非生物学引起的readcount的差异（最主要消除各个文库测序数据量不同带来的差异）。对于标准化的结果，我们采用MA-plot或box-plot来评价。图4.1.1MA-plot横坐标为表达量，纵坐标为log后的表达差异倍数基于大部分基因都是非差异表达的，所以大多点应在logfoldchange=0左右，并且不随表达量的变化而变化。4.2差异基因列表对于有生物学重复的的样品，我们采用DESeq2来分析差异表达基因。该方法基