RNA干扰技术

Introductionofsmallsegmentsofdouble-strandedRNAleadstospecificdegradationofthecorrespondingmRNA.RNA干扰技术一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；此外，siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国《科学》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）2006年的诺贝尔生理学奖获得者：AndrewZ.FireCraigC.MelloRNAi-----RNAinterferencesiRNAs-----SmallinterferingRNAs(小干扰性RNA)dsRNA------doublestrandRNA(双链RNA)RISC------RNA-inducedsilencingcomplex(RNA诱导沉默复合物)Dicer------RNAaseIII—relatedenzymes(RNAaseIII家族成员)PTGS------Post-transcriptionalgenesilencing转录后基因沉默Glossary(术语)(RNA干扰)RdRP-------RNA-directedRNApolymerase(RNA指导RNA聚合酶)转录后沉默Post-transcriptionalgenesilencing(PTGS)RNAi研究史20多年前，在对矮牵牛花（petunias）进行的研究中发现协同抑制现象cosuppression，导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。96年前后，研究发现注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1基因的表达；三年后，首次将双链RNA注入到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默效果，这种技术的成熟使得大规模筛选线虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究。在果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型。2001年Elbashir等《Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。牵牛花（petunias）协同抑制现象cosuppression，线虫的RNAi（左）两线虫带有含普遍性表达的GFP报告基因重组质粒的表达品系。（右）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体GFP信号消失（头部区域有些神经元对该效应具有抗性)。RNAi应答的基本特征:3、RNAi效应可以在线虫体内传播-------即传播效应。1、靶基因内源性序列不发生改变，即RNAi不引起稳定的遗传改变。2、发现细胞质中靶mRNA水平下降，但细胞核的mRNA前体数量未受影响。相应原核生物，位于操纵子的基因在RNAi不发生交叉反应。说明RNAi是在转录后发挥作用(PTGS)。4、每个细胞仅需要少量siRNA分子就可对大量mRNA发挥作用，提示存在某些放大和/或催化活性的因素在起作用例如：依赖RNA的RNA聚合酶（RdRP）的发现线虫中的随机降解性PCR模型RdRP-----依赖RNA的RNA聚合酶1、多种遗传学实验证实了RdRP在基因沉默中的重要作用,其活性是基因沉默机制中不可缺少的组分。（首先在线虫和果蝇中获证）2、果蝇和线虫提取物中的siRNA可以作为RdRP的引物，可以继续引导产生更多的dsRNA。这个过程成为----降解PCR（degradativePCR)3、RdRP的功能似是产生以单链RNA引导的dsRNA的合成，而dsRNA经dicer切割成siRNA，从而放大并维持PTGS效应。RNA-directedRNApolymeraseRICSRNA-inducedsilencingcomplexGenesilencing线虫中的随机降解性PCR模型哺乳动物细胞中的RNA干扰大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活，会引起非特异的基因表达抑制。这种抑制是通过以下两种途径之一进行的：长的dsRNA蛋白激酶(PKR)激活翻译起始因子eIF2a失活翻译抑制A诱导细胞凋亡RNaseL非特异的RNA降解激活B2’-5’寡聚腺苷酸合成酶研究发现不超过30个碱基的双链RNAs并不会激活PKR激酶途径哺乳动物细胞中的RNA干扰通过瞬时转染导入的siRNAs能够以序列专一的方式有效诱发培养的哺乳动物细胞的RNAi。siRNAs的效率各有区别——最有效的siRNAs能使靶RNA和蛋白水平降低90%以上。研究发现最有效的siRNAs是21个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。dTdT（UU）（UU）dTdT1.DegradationofthetargetmRNA(引起靶标mRNA的降解),2.InhibitionoftranslationofthetargetmRNA(抑制靶标mRNA的翻译),3.Silencingthegenetranscriptionfromthetargetpromoter(引起靶标启动子的转录沉默).ThetargetsoftheRNAi-directedgenesilencing（RNA干扰指导的基因沉默的结果）：1.Dicer:anRNaseIII-likemultidomainribonucleasethatfirstprocessesinputdsRNAintosmallfragmentscalledshortinterferingRNAs(siRNAs)ormicroRNAs(miRNA).DicerthenhelpsloaditssmallRNAproductsintoRISC.2.RISC(RNAinducedsilencingcomplexes)(RNA诱导的沉默复合物):alargemultiproteincomplexthatdirecttheboundsiRNAormiRNAtoitstargetandinhibitthetargetgeneexpression.TheheartoftheRNAimechanismRNAi机制的核心是：RNAi机制模式图在起始步骤，加入的dsRNA被Dicer酶切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA确定目的基因根据相对应的核酸序列设计出siRNA的序列获得siRNA用siRNA转染细胞分析RNA干扰的效果RNA干扰研究的一般流程siRNA的一般结构：哺乳动物：21-23bpdsRNA非哺乳动物：长片段dsRNAdTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的设计－－I如何选择siRNA靶位点：siRNA的设计－－II2、研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。1、从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。3、在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响RISC结合mRNA,从而影响siRNA的干扰效果。序列同源性分析：将siRNA序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如进行BLAST搜索分析（）选出合适的目标序列进行合成并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA设计阴性对照通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用housekeepinggenes作对照.补充：Whitehead研究所已研发了siRNA的自动选择方法，并于网站：上向公众开放．这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量，并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列，以防错配。疑难解答：•假如siRNA不起作用，应首先确定所使用的靶序列和细胞是否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。•应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRNA序列是否可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞中）或存在多态性。=1&mySort=5双链RNA合成非特异siRNA合成siRNA表达载体在细胞中表达siRNAs以PCR制备siRNA表达框进行体内转录利用病毒系统实现体内表达siRNA优点：不需要直接操作RNA体外转录法合成siRNA体内转录合成siRNAsiRNA的合成siRNAconstructionprocedure引导序列T7启动引物DuraScribe™T7TranscriptionKit通过高效的体外转录合成siRNA使用了特殊的T7RNA聚合酶，可以2’-F-UTP和2’-F-CTP为底物，生成带有氟修饰的RNA---DuraScribeRNA•这种带有修饰的RNA可以很好的抵抗RNaseA•双链的DuraScribeRNA可以被RNaseIII消化。•DuraScribeRNA不需要转染试剂就可进入细胞，并且无需去除血清。•双链oligoDNA,线形质粒，PCR产物都可以用作转录模板。产量，50ug/20ulInhibitionofHIV-1InfectionbySmallInterferingRNA-MediatedRNAInterference1JohnCapodici*,KatalinKarikóandDrewWeissman2,*TheJournalofImmunology,2002,169:5196-5201.非特异性siRNA合成----ShortCutRNAiKit大肠杆菌RNaseIII是一种识别双链RNA的内切酶，产物为3’端外悬2-3个碱基的双链短片段，与Dicer在真核生物RNAi途径中相同。利用RNaseIII消化得到的siRNA混合物直接转染细胞，通常能够保证目的基因被有效地抑制。优点：可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。缺点：有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNAFigure2:siRNAproductionbyShortCutRNaseIII:(A)VaryingamountsofShortCutRNaseIIIwereincubatedwith2µgofa500bpdsRNAf