RNA提取方法

RNA提取方法（TRIzol法）一、试剂准备1、TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇（0.1%DEPC配制）。2、塑料器皿需用0.1%DEPC水浸泡。3、0.1%DEPC水：100mldd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37℃孵育12h以上，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。二、操作步骤1、样品处理（1）组织：50-100mg组织中加入1mlTROzlo试剂。（2）单层细胞：加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。（3）悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1mlTROzlo试剂。2、将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。3、加入0.2ml（1mlTROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。4、于2-8℃12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。5、取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。6、于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。7、向沉淀中加入1ml75%乙醇，轻轻混匀。8、于2-8℃7500g离心5min后弃上清9、将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。三、注意问题1、在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60--70℃保存至少一个月。2、RNA沉淀（第6步）在75%乙醇中于2-8℃能保存至少一周，于-5--20℃能保存至少一年。四、RNA定量RNA（mg/mL）=40×OD260×稀释倍数（n）/1000RNA纯品OD260/OD280=2.0五、RNA电泳（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl1×TAE电泳缓冲液及1μl的10×载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。