临床分子检测参考物质及室内质量控制-李金明

临床分⼦子检测参考物质及室内质量控制  李金明国家卫生计生委临床检验中心    全国临床分子检测质量保证大会  2017.11.9-­‐11.  广州临床常⽤用的分⼦子检测项⺫⽬目 Ø 病原微⽣生物核酸检测Ø 遗传病基因检测Ø 肿瘤基因突变检测Ø 药物基因组SNP检测Ø ŸŸŸŸŸŸ方法Ø 荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS）、PCR-高分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等）Ø PCR-杂交法（膜上、芯片[基因芯片]、乳胶颗粒[Luminex]）Ø PCR-Sanger测序Ø PCR-焦磷酸测序Ø PCR-新一代高通量测序（NGS）Ø PCR-SSCP、RFLP、dHPLCØ 基于PCR的微流控芯片Ø 荧光原位杂交Ø 直接杂交一些其他基因扩增检验方法：TMA、NASBA、LAMP、LCR等。非扩增的信号放大：bDNA分子诊断（Moleculardiagnostics）概念发展Ø 采用分子生物学方法（基因扩增、测序、杂交、蛋白质组分析、代谢组学分析等）检测患者体内特定遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断。Ø 分子诊断的靶标包括DNA、RNA、蛋白质和小分子代谢物。分子诊断的组学概念• 测序：Sanger测序、新一代高通量测序• 荧光PCR：实时荧光定量PCR、ARMS、HRM、数字PCR等、• PCR-杂交法：膜上、芯片[基因芯片]、乳胶颗粒[Luminex]• PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等• 荧光原位杂交、直接杂交• 其他基因扩增检验方法：TMA、NASBA、LAMP、LCR等基因组学• 基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片• 基于序列分析的基因表达系列分析SAGE（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）• 高通量测序转录组学• 双向凝胶电泳• 等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）• 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS蛋白质组学代谢组学• 代谢物指纹分析（metabolomicfingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法• 代谢组学分析（metabolomicprofiling）• 核磁共振（NMR）分⼦子检测的伴随诊断（companiondiagnostics）概念Ø Acompaniondiagnosticisamedicaldevice,oftenaninvitrodevice,whichprovidesinformationthatisessentialforthesafeandeffectiveuseofacorrespondingdrugorbiologicalproduct.Thetesthelpsahealthcareprofessionaldeterminewhetheraparticulartherapeuticproduct’sbenefitstopatientswilloutweighanypotentialserioussideeffectsorrisks.Ø Companiondiagnosticscan:u identifypatientswhoaremostlikelytobenefitfromaparticulartherapeuticproduct;u identifypatientslikelytobeatincreasedriskforserioussideeffectsasaresultoftreatmentwithaparticulartherapeuticproduct;oru monitorresponsetotreatmentwithaparticulartherapeuticproductforthepurposeofadjustingtreatmenttoachieveimprovedsafetyoreffectiveness.u Ifthediagnostictestisinaccurate,thenthetreatmentdecisionbasedonthattestmaynotbeoptimal.保证分⼦子检测质量的基本要素 Ø 检测试剂⽅方法或检测系统是好的：涉及试剂⽅方法研发和系统化中的性能确认（validation）Ø 实验室检测过程是可靠的：涉及商品试剂⽅方法的性能验证（verification）;定量检测的校准；室内质量控制（监测精密度或重复性）和室间质量评价（监测结果可⽐比性或准确度）要实现上述两个基本要素，均离不开⼀一种物质，即参考物质（referencematerials）  参考（标准）物质或参考标准品(ReferenceMaterials，RM；Referencestandards,RS)Ø Areferencemeterialorstandardisdefinedasamaterialthatissufficientlyhomogeneousandstablewithrespecttooneormorespecifiedproperties,whichhasbeenestablishedtobefitforitsintendeduseinameasurementprocess.Thesepropertiescanbequalitativeorquantitative.Ø 具有一种或多种足够均匀、稳定和很好地确定了的定性（如特定DNA分子序列）或定量（如特定DNA分子丰度）特性,以使作适用于测量过程中的预期用途（校准测定装置、评价测量方法或给材料赋值）的一种材料或物质。InternationalOrganizationforStandardization.ISOGuide30:2015—ReferenceMaterials—SelectedTermsandDefinitions(ISO,2015)测定方法⼯工作程序 标准化参考或标准物质可比的结果参考或标准物质提供者Ø 可提供标准物质的国际标准化组织有：WHO生物学标准化专家委员会（ECBS）、英国国家生物学标准和质控物研究所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,NIBSC)、美国NIST和CDC、国家卫生研究所（NIH）、IFCC等；Ø 国内有中国药品生物制品检定研究院、国家卫生计生委临床检验中心国际及国内标准物质分级Ø 国际标准物质分级:可分为第一,第二和第三等三个等级.一级标准数量有限,可使用10-20年,是冻干品,内含载体蛋白.一级标准可用来校准第二和第三级标准.国际标准品(IS)中作为第一级标准,二级标准可用来维持校准.Ø 国内标准物质分级：一级和二级。病原体核酸国际标准物质的单位Ø IU（InternationalUnit）/mL病原体核酸检测国际标准物质项目研制者发布年编号浓度（IU/ml）项目研制者发布年编号浓度（IU/ml）HBVDNANIBSC（第⼀一代）199997/746;97/750106PlasmodiumfalciparumDNANIBSC201204/176)5×108IU/vialNIBSC（第三代）201410/264850,000HPV16DNANIBSC201306/2025×106IU/vialHCVRNANIBSC（第⼀一代）199796/790105HPV18DNANIBSC201306/2065×106IU/vialNIBSC（第⼆二代）200596/798105HIV-2RNANIBSC201408/1501,000NIBSC（第三代）200606/100105HCMVNIBSC201409/1625×106IU/vialNIBSC（第四代）201406/102260,000EBDNANIBSC201409/2605×106IU/vialHIV-1RNANIBSC（第⼀一代）199897/656105（IU/瓶）ToxoplasmagondiiDNANIBSC201410/2425×105IU/vialNIBSC（第三代）201210/152185,000ParvovirusB19DNANIBSC（第⼀一代）200099/800106HAVRNANIBSC（第⼀一代）200300/560105NIBSC（第⼆二代）201009/110105-106NIBSC（第⼆二代）201400/56254,000病原体核酸检测国家标准物质项目研制者发布年编号浓度（IU/ml）HBVDNANCCL2005GBW(E)090031（二级）1.03±0.21NCCL2007GBW09150（一级）1.20±0.24HCVRNANCCL2005GBW(E)090032（二级）1.29±0.24NCCL2007GBW09151（一级）1.11±0.27HCVRNANCCL2010GBW(E)090114（二级）（3.42.9）×103（液体系列）NCCL2010GBW(E)090115（二级）（6.73.1）×103NCCL2010GBW(E)090116（二级）（7.45.2）×104NCCL2010GBW(E)090117（二级）（4.32.6）×105NCCL2010GBW(E)090118（二级）（5.84.8）×106HPV-16DNANCCL2014GBW09189（一级）HPV-18DNANCCL2014GBW09190（一级）CMVDNANCCL2016HBVDNA1IU/ml等于？拷贝/mlØ 1IU/ml=5~6拷贝/ml?(2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》:HBVDNA的检测值可以国际单位(IU)/mL或拷贝/mL表示，根据检测方法的不同，1IU相当于5~6拷贝。)Ø 国内临床医生通常对于采用国产HBVDNA实时荧光定量PCR试剂检测结果也按这个来换算，以为是一个通用的计算公式，这是错误的。Ø 因为1IU相当于5〜～6拷贝，不具有普遍性，不适用于所有商品试剂盒。Ø 如果说1IＵ/ml相当于罗氏（Roche）的Cobas、BayerbDNA等检测系统的5〜～6拷贝/ml，则是较为准确的。Ø 这是因为在HBVDNA检测的商品检测系统昀早应用的是Cobasamplicor，其结果报告单位是拷贝/ml，其后其它一些商品试剂如支链DNA（branchedDNA,bDNA）、Digene杂交捕获试验等也是用的拷贝/ml，但不同方法间的拷贝/ml没有可比性。Ø 世界卫生组织（WHO）的HBVDNA标准物质（97/746,106IU/ml)在2000年发布后，罗氏公司即用其Cobasamplicor检测系统（PCR-ELISA）检测了该标准物质，发现1IU/ml约等于其检测系统的5.26拷贝/ml，后来，罗氏又研发了基于实时荧光PCR的Cobas-Taqman检测系统，检测后，1IU/ml约等于5.82拷贝/ml。Ø Bayer采用theVERSANTHBVDNA3.0assaybDNA检测系统，1IU/ml约等于5.6拷贝/mlNGS参考物质HardwickSA,DevesonIW,MercerTR.Referencestandardsfornext-generationsequencing.NATREVGENET,2017.高通量测序（NGS）的临床应用Ø 染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）Ø 胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（PreimplantationGeneticDignosis，PGD）