化学蛋白质组学与药物靶点的发现

药学学报ActaPharmaceuticaSinica2011,46(8):877−882·877·化学蛋白质组学与药物靶点的发现杨红芹1,2,李学军1*(1.北京大学基础医学院药理学系,北京100191;2.保山中医药高等专科学校,云南保山678000)摘要:小分子药物靶点的发现对于生物和医学的研究者而言,是一项既重要又艰巨的任务,医学和药学界研究工作者急切需要发现和确认新的靶点。为了克服药物靶点确认的瓶颈,已经发展了许多新技术用以研究小分子化合物与蛋白质分子间的相互作用,其中包括化学蛋白质组学方法。化学蛋白质组是全蛋白质组学研究的一个亚类,化学蛋白质组学是利用能够与靶蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组,在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能以及蛋白质与化学小分子的相互作用,从而准确找到药物作用靶点的组学研究方法。化学蛋白质组学技术和方法不断成熟,在药物作用靶点的发现、确认和药物多靶点研究等方面都将起到重要的作用,并将大大提高药物发现的效率。关键词:化学蛋白质组学;小分子;药物靶点;药物发现中图分类号:R966文献标识码:A文章编号:0513-4870(2011)08-0877-06ChemicalproteomicsanddiscoveryofdrugtargetsYANGHong-qin1,2,LIXue-jun1*(1.DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China;2.BaoshanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Baoshan678000,China)Abstract:Medicalcommunityandpharmaceuticalcompaniesarecurrentlyfacingadireneedfordiscoveryandidentificationofnewdruggabletargets.However,thediscoveryofsmall-moleculetargetisanimportantandarduoustaskforthebiologicalandmedicalscientists.Toovercomethebottlenecksfortargetvalidation,manynewapproachesarebeingdeveloped,suchaschemicalproteomics.Asapartofproteomicsapproaches,chemicalproteomicsemployssmall-moleculecompoundsthatcanspecificallyinteractwiththetargetproteintointerferewithanddetectproteomics.Therefore,newtargetidentification,drugdiscoveryandresearchonmulti-target-directeddrugswillallbebenefitedfromthefurtheradvancesinchemicalproteomicsapproaches.Chemicalproteomicshasthepotentialtogreatlyenhancetheefficiencyofthedrugdiscoveryprocess.Keywords:chemicalproteomics;small-molecule;drugtarget;drugdiscovery人类应用小分子药物治疗疾病已有数千年的历史,虽然已经发展了许多蛋白质相互作用研究技术用以研究小分子化合物与蛋白质分子之间的相互作用,寻找作用靶点,并进行药物开发,但许多小分子药物的作用靶点和作用机制仍不清楚,靶点的探测收稿日期:2011-02-16.基金项目:国家自然科学基金资助项目(81020108031,30572202,30973558,30772571).*通讯作者Tel/Fax:[phone],E-mail:[e-mail]和发现仍处于瓶颈阶段[1]。小分子药物作用的靶点通常是蛋白质,要对药物作用靶点有全面和深入的认识,必须要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。传统的对单个蛋白质研究的方式已经无法对蛋白质功能和蛋白质间的相互作用进行完全的阐述,因此产生了一门新兴学科——蛋白质组学(proteomics),它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的组学研究方法。蛋白质组学的研究内容有两个重要方面:结构·综述·DOI:10.16438/j.0513-4870.2011.08.011·878·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2011,46(8):877−882蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质结构模式的研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析;功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质功能模式的研究是蛋白质组学研究的昀终目标,其研究方法与传统的蛋白质研究技术不同,它是应用许多新技术手段,通过系统性、整体性研究,并从相互联系的新视角来研究,以便得到生物体生理、病理和信号转导过程的功能整合信息。化学在这里与生物学的昀新发展融合,形成新的交叉研究领域——化学蛋白质组学(chemicalproteomics)[2,3]。1化学蛋白质组学的概念化学蛋白质组是全蛋白质组的一个亚类,而化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域,学术界至今对其尚未有确切定义,作为后基因组时代的新技术,是联系蛋白质组和药物靶点研究及新药研究的桥梁和纽带[4]。化学蛋白质组学有别于以往的主要以蛋白质定性定量鉴定为基础(identity-basedorabundance-based)的蛋白质组学技术[5]。化学蛋白质组学是利用能够与靶蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组,在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能及其与化学小分子的相互作用,从而准确找到化学小分子(包括药物)的结合部位——作用靶点的组学研究方法。因此,化学蛋白质组学被认为是很有前途的新一代基于功能的蛋白质组学技术(function-basedproteomics)[3]。2靶点的概念小分子靶点是能够与小分子化合物发生特异性结合,并能产生特异的生理效应或药理效应,调节机体生理功能或防治疾病的生物大分子。目前药物的靶点主要是蛋白质。小分子药物与靶蛋白的相互作用是很多药物发挥生物学功能的基础[6]。细胞内挤满了密集的蛋白质,一个小分子化合物进入细胞可以遇到许多不同的蛋白质,并产生不同程度的相互作用。这种相互作用强弱不一,既可以是可逆的,也可以是不可逆的;可以是单靶点的,也可以是多靶点的作用,对机体生理学功能或药物作用产生影响[7]。目前已知的药物作用靶点约有500个,而根据人类基因组研究结果预测的细胞内药物分子能作用的靶点应远远超过500个,据保守估计,约有5000～10000个药物靶点,是目前已知靶点数目的10～20倍[8]。显然,“一个药一个靶点”的说法并不正确,已发现很多复合物的作用比原先预期的复杂得多,有的能导致副作用,而有的可能展现出其他医学用途[5]。当研究向系统生物学和个性化医疗发展时,分析化学小分子与靶点相互作用的信号和代谢规律变得日益重要,医学和药学界急需发现和确认新的靶点[9]。小分子靶点的发现和确认对于生物和医学的研究者而言,是一项既重要又艰巨的任务。而应用化学蛋白质组学方法能在上千万个蛋白质分子中分辨出正常和病变蛋白质的细微区别,以便药物的靶向鉴别[10]。3化学蛋白质组学研究方法化学蛋白质组学是化学生物学研究的重要技术手段,随着科学技术的进一步发展,化学蛋白质组学的研究方法也不断更新,目前的方法有以下几种。3.1常用的化学蛋白质组学研究方法化学蛋白质组学研究方法的一般流程是,先将化学探针或小分子化合物与蛋白质提取液进行共孵育,然后利用亲和层析等方法将这些蛋白质加以分离,再通过高灵敏度的质谱进行鉴定,昀后对它们做进一步的生物信息学分析[11]。主要有如下两种方式[1,5]。3.1.1基于活性的蛋白质谱分析(activity-basedproteinprofiling,ABPP)生物体的蛋白质组要比基因组大得多,通常都是在整体水平上研究感兴趣的功能蛋白质。美国Scripps研究所的Cravatt小组发展了一种新的化学蛋白质组学技术,利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针(activity-basedprobes,ABPs)来探测功能蛋白质组,利用活性小分子探针来识别蛋白质靶点,这种方法建立了一种非常有效的未知靶点发现的策略[1]。化学探针即探测用的工具,是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子,并可以被特殊的方法所检测[2]。就化学探针的基本结构而言,包括3个特异的功能部位:与酶共价交联的反应基团,调节反应基团反应的链接区和一个便于鉴别和纯化目标酶的标记物。现有的化学探针多以半胱氨酸蛋白酶家族和丝氨酸水解酶家族为靶点[2,12]。除了化学探针的数目在不断增长,许多抑制剂或亲和标记试剂的出现都将有助于发展出新类型的探针。ABPP技术的原理是合成同时带有反应基团和标签基团的ABPs试剂与待研究的蛋白质组作用:ABPs中的反应基团能够特异性共价修饰蛋白质组中的某类酶蛋白而将化学小分子“挂”到感兴趣的靶酶上,然后利用ABPs中的荧光或生物素标签基团又杨红芹等:化学蛋白质组学与药物靶点的发现·879·可将这些靶酶一个个地从蛋白质组中“钓”出来,由于ABPs是针对待研究靶酶的活性而定向设计的化学小分子,因而能够直接检测蛋白质组中感兴趣的靶酶的活性[3,13]。通常,ABPP用来检测某些情况下,例如某疾病中,有活性的限定酶种类的成员[5]。此方法能用于具有不同生物化学活性的新蛋白质的鉴别,或用于确定以某酶家族为靶点的药物的选择性分析,通过用药物预处理,用合适的反应探针进行后续标签和识别剩余的酶,再结合计算机技术处理复杂的蛋白质组学数据,可得到高精度的细胞靶蛋白模型。3.1.2以化合物为中心的化学蛋白质组学技术(compound-centricchemicalproteomics,CCCP)3.1.2.1靶点发现的经典方法——亲和层析法迄今为止有很多靶点发现的技术,但亲和层析仍然是昀为常用的方法[14]。经典的工作会从结构-活性关系(structure-activityrelationship,SAR)研究开始,通过对不同功能的目标化合物进行修饰或剔除,以确定哪些结构对于药物活性是非必需的。这些非必需的位点就被用于连接到一个亲和标签,比如生物素(biotin)或者固体基质胶、Affi-Gel琼脂糖珠子,然后与用抗体和蛋白免疫共沉淀特异蛋白质类似,连接了药物的珠子与蛋白质提取物共孵育,再高强度洗涤掉非特异性结合的蛋白质,昀后紧密结合的蛋白质由过量的游离药物洗脱下来或者通过高度变性条件洗脱。昀为常见的分析洗脱下来的蛋白的方法是通过SDS-PAGE电泳以及质谱鉴定蛋白条带检测。考虑到一般都有比真实药物靶点更多的非特异结合蛋白,常同时进行相似标签标记的母核化合物的同源化合物的阴性对照试验。一旦可能的靶点被发现,接下来的研究就是确认直接结合的靶点以及生物学作用。亲和层析的昀大局限性在于必须获取目标化合物的衍生物。结构-活性关系研究不仅耗费时间而且需要大量的药物化学方面的专门技术,而这恰恰是进行化学遗传学研究及小分子表型筛选的研究室所缺乏的。即使可以做到,大量的小分子也不能在不影响生物活性及可能结合的情况下被修饰,而且也不易获得和合成足够数量的化合物以满足结构-活性关系研究以及后续的实验。尽管如此,与其他新近发展的依靠不同表型或者分子特征去缩小可能靶点范围的靶点发现方法相比,基于亲和标记的方