TRIZOL法提取总RNA

实验总体安排1．大鼠GAPDH基因的钓取、克隆和鉴定：大鼠肝细胞总RNA的提取，凝胶电泳检测GAPDH基因的RT-PCR扩增（普通聚合酶）RT-PCR产物的胶回收连接入T载体、转化（GAPDH基因的TA克隆）挑单克隆，摇菌过夜、提质粒酶切鉴定，电泳检测专题•2.humanIL8ELISA检测•3.报道系统的单光子检测TRIZOL法提取总RNA简介•研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。•RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。•Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性。在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀火的RNARNase•它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。•RNase的又一污染源是取液器，包括枪头和EP管等RNase处理•所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤。•全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套。•配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌。从组织中提取RNA•本实验目的：提取大鼠总RNA•组织来源：大鼠肝脏。•每组做两个样品步骤•解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂。匀浆。•移入1.5mlEp管中，室温静置5min。•每1mlTRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。•4℃离心，12,000g×15min。•仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。•加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。•4℃离心，12,000g×10min。•弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。•弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl无RNase水重悬沉淀。•核酸定量或电泳检测。多余样品-70℃保存备用。注意事项•抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理。•全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套•样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。电泳检测•琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法•琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度。•DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。•琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。•溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项•EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。•实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。实验步骤（1）0.25g琼脂糖加入25ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（2）冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。（3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。（4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。（5）用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl的6Xloadingbuffer，混匀后，小心加入点样孔。(6)打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min。上样预染色的标本电泳检测结果：RNA提取：关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。核酸定量•组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变。但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。•在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数×50/1000（ug/ul）RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数×40/1000（ug/ul）•故根据OD260/OD280的比值可以估计核酸的纯度：DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有RNA污染，若RNA样品比值高于2.0，则提示RNA有降解。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。实验步骤•取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE）至100ul，混匀。•将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读数。核酸定量仪将直接给出样品浓度。RT-PCRRT-PCR•RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。mRNAcDNAPCR产物反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCR特异性引物,Taq酶OligodT,逆转录酶用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、mRNA丰度RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物:OligodT)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNA1.逆转录：实验步骤•取1μg总RNA于一PCR管，70℃反应10min，轻轻离心后置于冰上。•2）建立20μlRT反应体系：•MgCl24μl•10×RT缓冲液2μl•dNTPMixture（10mM）2μl（1.25mmol/L）•RNaseinhibitor0.5μl•逆转录酶1μl（200U）•Oligo(dT)15引物1μl•总RNA1μg•加无核酶水至总体积20μl•涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分钟。AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’cDNArTaq2.PCR:GAPDHGAPDHGAPDH(sense)GAPDH(antisense)cDNA、缓冲液、dNTP、rTaq、引物（特异引物)、Mg2+实验步骤建立PCR反应体系：RT获得逆转录反应得到的cDNA5μl5.0μM的GAPDH混合引物2μl10×PCRbuffer5μl10mMdNTPs1μlTaqDNA聚合酶0.5μlMgCl24μlddH2O32.5μlTotalvolume50μl•按下列程序运行循环：step195℃变性4minstep295℃变性45secstep353℃复性45secstep472℃延伸90sestep572℃温育10minstep64℃保存24hrs•step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。