华农基因工程实验报告

1实验报告实验项目名称：基因工程综合实验实验项目性质：综合性实验所属课程名称：基因工程班级：11生物工程1班学号：秋叶指导老师：陈忠正实验完成时间：2014年5月11日2目录：0.摘要..................................................31.前言..................................................32.实验材料和仪器................................................32.1实验材料2.2实验仪器.3.实验试剂..........................................43.1DNA提取所需试剂3.2PCR实验所需试剂3.3双酶切实验所需试剂4.实验步骤...........................................44.1质粒DNA提取4.2聚合酶链式反应（PCR）4.3质粒DNA的双酶切分析4.4琼脂糖凝胶制备5.实验结果与分析...........................................75.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果5.2PCR扩增实验结果5.3质粒DNA的双酶切分析结果3摘要：实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒1前言本次实验对象为含有重组了1kbDNA片段的PET32.a表达质粒。该表达质粒中长度约6kb。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA，最后得到纯化后的DNA质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。PCR(聚合酶链式反应）是根据DNA双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。本次实验我们将以纯化后的质粒DNA作实验材料，在预先设计好引物后用PCR技术扩增目的片段。在PCR实验的同时，我们将利用提取的质粒DNA作目的序列的双酶切实验。限制性内切酶能在适当温度、pH等条件下识别DNA序列中的特定序列并对识别序列进行有效切割。利用琼脂糖凝胶电泳，我们可以通过电泳结果检验DNA提取纯度、PCR和双酶切实验的效果，并对比各组实验效果了解实验各步骤的各项影响因素核试验操作。2实验材料和仪器2.1实验材料4大肠杆菌DH5α（含重组了约1000bpDNA片断的PET32.a表达质粒，Amp抗性）2.2实验仪器高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪。3实验试剂3.1DNA提取所需试剂3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldviewDNA染色剂、氯仿、琼脂糖溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA(pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3mol/LKAc，用冰醋酸调pH值至5.2；3.2PCR实验所需试剂实验一提取的质粒DNA，0.5U/μL的Taq酶及5×PCRbuffer、1mmol/L的dNTP、克隆基因特异引物PF、PR（各1µmol/L），0.2mL的PCR管，TIP头，goldviewDNA染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE、markerDNA等。PCR扩增引物：PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG—3`PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA—3`3.3双酶切实验所需试剂实验一提取的质粒DNA，BamHI（3U/μL），HindⅢ（3U/μL），1.5mL的EP管，TIP头，goldviewDNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE等。4实验步骤4.1质粒DNA提取4.1.1取1mL菌液放入Ep管中，12000r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（注：先倒液体入废液缸，再倒扣用吸水纸吸干液体，残留液体可移液器吸干）54.1.2加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀；4.1.3加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；4.1.4加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min（常温也可，但产量可能下降），12000rpm离心5min；吸上清至另一新的1.5mLEP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；4.1.5小心移取上清液500μL至另一新的1.5mLEP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制备琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；4.1.6加入20μLRTE（含10μg/mLRNaseA的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min（时间充分可以考虑放置30分钟，以充分消化RNA）。4.1.7取4～5μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8μLTE及2μL上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。4.1.8打开电源开关，调电压为80~100伏进行电泳(注意电泳方向！！！)。4.1.9电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。4.2聚合酶链式反应（PCR）4.2.1PCR反应液配制：反应体系为20µL（请先计算出如下各成分所需加入的量）反应液组分起始浓度反应系终浓度20µL反应体系所需量（请计算）DNA模板提取的质粒5ng到10ng取2μL已稀释10×的质粒DNA溶液引物PF10µmol/L0.2µmol/L2μL引物PR10µmol/L0.2µmol/L2μLdNTPmix2.5mmol/L0.25mmol/L2μL反应buffer10×1×10μLTaq酶0.5U/µL20µL体系加1U2μL4.2.2把上述配制的反应液体系放置于PCR仪中，并使PCR仪运行如下PCR反应程序，实现靶DNA的扩增：694℃3min→94℃50sec→54℃50sec→72℃1.5min→72℃5min↑20循环↑4.2.3PCR扩增过程中，全班分组按实验一的方法制备1％的琼脂糖凝胶；4.2.4PCR结束后取10µL反应产物，加入2µL上样缓冲液，混匀并全部上样于1％琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µLmarkerDNA做标准分子量大小对照；4.2.5接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟；4.2.6切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果；4.3质粒DNA的双酶切分析4.3.1在一1.5mL离心管中配制质粒双酶切反应液：（反应体系为20µL）加入成分加入量质粒DNA8μL10×Buffer3μLBamHI2μLHindⅢ2μLddH2O（无菌水）5μL用移液器tip头轻轻混匀4.3.237℃恒温条件下酶切反应约1-1.5h（酶切过程中，全班按实验一的方法分组各制备1％的琼脂糖凝胶）；4.3.3酶切结束后，往酶切反应管中加入4μL6×上样缓冲液，轻轻混匀；4.3.4取10μL酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL标准分子量markerDNA；4.3.5接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟；4.3.6切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果；4.4琼脂糖凝胶制备4.4.1称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中；74.4.2加入30mL0.5×TBE于三角瓶中，称出总重量并记录；4.4.3在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量（注意不要烫到手！！）；4.4.4室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度（即以手敢捏三角瓶为准，注意过程中要经常摇动防止降温不均匀导致局部凝固现象），此时再加入1.5μLgoldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5μL)，混匀；4.4.5把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固（一般需要20分钟以上）；4.4.6小心拔掉梳子，把凝胶连同胶膜一起转移到电泳槽中（TBE缓冲液的添加以没过胶面1～2毫米为宜，注意电极方向），即可用于点样和电泳检测。5实验结果与分析5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果由于实验操作不熟练，在添加上样缓冲液时不慎弄出了许多气泡，导致上样时基本吸不出来样品，从而上样量很少，最后电泳结果如图（左图）所示并不清晰右图为别组实验结果。其实我组实验结果中1号样品还是能看到一点，仔细看能看到如右图4号样品相似的结果。右图中4号样品有多条相近的条带，原因是提取的质粒DNA尽管相对质量相同，但由于各种因素导致会出现螺旋,线形和开环（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像。经了解，三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋线形开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。5.2PCR扩增实验结果8鉴于之前实验的经验，本次在添加上样缓冲液时有所注意并抓到了窍门，混匀后的样品基本没有气泡，但上样时依然遇到一些问题，图不少县戳破了凝胶，导致样品从凝胶下方漏掉了，结果图中3号、4号和6号样品没能出结果。图中1号、2号、5号样品在1kb位置有条带显示，表明目的序列得到了扩增，其中从显色效果可以看出，5号样品扩增结果最为理想。据了解，PCR基本影响因素有变性-退火温度、引物设计、温度循环参数、不同的DNA聚合酶、模板序列本身。其中模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢