电子显微镜的原理与演示电子显微镜的原理与演示电子显微镜的原理与演示演示实验演示实验分辨力分辨力(resolution):指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示。一、电子显微镜出现的必然性一、电子显微镜出现的必然性一、电子显微镜出现的必然性N.A.λ0.612D=光源的波长镜口率(N.A.)1.分辨力1.1.分辨力分辨力可见光波长为400~700nm(平均550nm)取决于镜口角和物镜与标本间介质的折射率波长:波长:镜口率镜口率(N.A.)(N.A.)的大小:的大小:2sin..α⋅=nAN镜口角物镜与标本之间介质的折射率空气的折射率为1水为1.33香柏油为1.515α-溴萘为1.66α紫外光显微镜:紫外光显微镜:0.10.1μμmm光镜分辨力的最小数值:≤≤0.20.2μμmm一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500×光学分辨率的极限!光学分辨率的极限!☺☺有效放大:有效放大:指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。无效放大:无效放大:各种光与电子束的波长比较各种光与电子束的波长比较各种光与电子束的波长比较名称波长(nm)可见光可见光760~390760~390紫外光紫外光390~13390~13XX--射线射线13~0.0513~0.05γγ--射线射线1~0.0051~0.005电子束电子束100V100V0.1230.12310,000V10,000V0.01220.0122100,000V100,000V0.003870.00387电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比:电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比:λ∝1√V电子显微镜与光学显微镜的异同点电子显微镜与光学显微镜的异同点电子显微镜与光学显微镜的异同点1,000,0001,000放大倍数0.1nm0.2~0.1μm分辨力电聚焦机械聚焦聚焦方式电磁透镜电磁透镜光学透镜光学透镜透透镜镜真真空空空空气气介介质质短:0.003~0.008长:200~750波长(nm)电子束电子束光光束束照照射射光光电子显微镜光学显微镜2.电镜与光镜的对比2.2.电镜与光镜的对比电镜与光镜的对比电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解二、电镜的分类二、电镜的分类二、电镜的分类根据电子束和样品之间作用方式的不同,可将电镜分为4大类:1)物体透射电子2)物体发射电子3)物体反射电子4)物体吸收电子透射电镜透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜扫描电镜观察和分析样品的内部结构观察和分析样品的表面立体形貌三、透射式电子显微镜三、透射式电子显微镜三、透射式电子显微镜真空系统供电及保护系统电子照明系统成象系统观察记录系统11、透射电镜的结构、透射电镜的结构电子照明系统成象系统观察记录系统真空系统供电及保护系统透镜系统或电子光学系统透射电镜的结构透射电镜的结构一般电镜超高压电镜真空系统抽真空的意义:抽真空的意义:防止灯丝的氧化损伤;确保电子束在运行过程中的运动轨迹不受空气分子干扰;去除空气分子对样品的污染。→1.3×10-12Pa离子泵离子泵真空涡流泵真空涡流泵机械泵:机械泵:油扩散泵:油扩散泵:冷阱:冷阱:真空管道、阀门、储气罐等真空管道、阀门、储气罐等1Pa→1.3×10-5~10-6Pa;1.3×10-6Pa→1.3×10-7~10-9Pa1.3×10-9Pa→1.3×10-10Pa真空系统的组成部件:真空系统的组成部件:真真空空系系统统供电及保护系统的组成部件及其作用:供电及保护系统的组成部件及其作用:供供电电及及保保护护系系统统高电压低电流的高压电源高电压低电流的高压电源::产生高速电子低电压高电流的透镜电源低电压高电流的透镜电源::控制高速电子束的运动轨迹一般电镜均拥有两个电源:一旦电镜的某一部分发生故障,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜!稳压和稳流装置:保证电压和电流的高度稳定保护与控制系统:电子照明系统的组成部件及其作用:电子照明系统的组成部件及其作用:电电子子照照明明系系统统℡℡电子枪:电子枪:产生高压电子束℡℡两级聚光镜:两级聚光镜:会聚高压电子束,以得到极细而均匀的电子束流第一聚光镜:将电子束的直径缩小20~60倍第二聚光镜:将电子束的直径扩大1~2倍第二聚光镜第二聚光镜放大第一聚光镜第一聚光镜缩小高压(V)高压电子束灯丝栅板阳极电子枪电子枪成象系统的组成部件及其作用:成象系统的组成部件及其作用:成成象象系系统统℡样品室℡℡样品室样品室℡成像与放大装置℡℡成像与放大装置成像与放大装置冷阱样品放置室液氮罐金属导杆放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物镜中间镜I中间镜II投影镜吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度降低温度可防止电子的热漂移铜网样品观察记录系统的组成部件及其作用:观察记录系统的组成部件及其作用:观观察察记记录录系系统统注意:电镜照相与普通照相不同,图像的反衬度最低时才是正聚焦;且底片还必须要经过预干燥处理观察室观察室观察室/放大镜//放大镜放大镜照相装置照相装置照相装置透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像保护眼睛荧光屏荧光屏铅玻璃窗铅玻璃窗用于放大投到荧光屏上的图像电子形成的荧光图像衰减速度很快,一旦观察到理想的结构图像就需要尽快照相22、透射电镜的成像原理、透射电镜的成像原理获得高分辨率的图像:数百万倍数百万倍使用电子枪发射出了波长极短的电子波利用电磁透镜可对电子束进行聚焦、放大和成像高速电子束透射样品电能转变成光能图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构高压电子枪高速电子束电磁透镜样品电子束发生投射荧光屏浓淡不同的图像成像原理:成像原理:成像原理:透射电镜照片演示透射电镜照片演示微管蛋白的免疫荧光照片微管蛋白的免疫荧光照片一个植物细胞的透射电镜照片一个植物细胞的透射电镜照片一个植物细胞的透射电镜照片图像各处浓淡的不同真实反映了样品中不同部位的物质结构图像各处浓淡的不同真实反映了样品中不同部位的物质结构透透射射电电镜镜照照片片演演示示糙面内质网的透射电镜照片糙面内质网的透射电镜照片糙面内质网的透射电镜照片透透射射电电镜镜照照片片演演示示多核糖体的透射电镜照片多核糖体的透射电镜照片多核糖体的透射电镜照片透透射射电电镜镜照照片片演演示示玉米分散高尔基体的透射电镜照片玉米分散高尔基体的透射电镜照片玉米分散高尔基体的透射电镜照片透透射射电电镜镜照照片片演演示示线粒体的透射电镜照片线粒体的透射电镜照片线粒体的透射电镜照片叶绿体的透射电镜照片叶绿体的叶绿体的透射电镜透射电镜照片照片透透射射电电镜镜照照片片演演示示细胞核的透射电镜照片细胞核的透射电镜照片细胞核的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片有丝分裂器的透射电镜照片凋亡细胞凋凋亡亡细细胞胞正在杀肿瘤细胞的T细胞正正在在杀杀肿肿瘤瘤细细胞胞的的TT细细胞胞透透射射电电镜镜照照片片演演示示αα--辅肌动蛋白辅肌动蛋白热休克蛋白热休克蛋白Hsp60Hsp60笼形笼形蛋白蛋白透透射射电电镜镜照照片片演演示示金的原子布阵的透射电镜照片金的原子布阵的透射电镜照片金的原子布阵的透射电镜照片透透射射电电镜镜照照片片演演示示T4噬菌体负染色的透射电镜照片T4T4噬菌体噬菌体负染色负染色的透射电镜照片的透射电镜照片图像各处浓淡的不同与样品中不同部位的物质结构相反图像各处浓淡的不同与样品中不同部位的物质结构相反透透射射电电镜镜照照片片演演示示螺原体螺原体驱动蛋白驱动蛋白核纤层蛋白核纤层蛋白纤毛动力蛋白纤毛动力蛋白胞质动力蛋白胞质动力蛋白在透射电镜中,被观察粒子的在透射电镜中,被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来;否则,电子束就会发被分辨出来;否则,电子束就会发生绕射,无法看到粒子生绕射,无法看到粒子!!扫描电镜扫描电镜透射电镜透射电镜光光镜镜肉眼玻璃透镜(目镜)投影镜玻璃透镜(物镜)样品玻璃透镜(聚光镜)光源(卤灯或汞灯)高压电子枪样品电磁透镜束偏转器图像投到视屏上荧光屏光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解四、扫描电镜的结构与成像原理四、扫描电镜的结构与成像原理四、扫描电镜的结构与成像原理1.扫描电镜的基本结构1.1.扫描电镜的基本结构扫描电镜的基本结构电子光学系统电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理及显示系统真空系统供电保护系统等扫描电镜扫描电镜电子枪电磁透镜扫描线圈样品室信号的收集处理系统真空系统供电保护系统显示系统(显象管)(1~10KV)电子枪灯丝电磁透镜探测器电磁透镜扫描线圈的束偏转器样品托样品显象管电子光学系统电子光学系统扫描电镜的结构简图扫描电镜的结构简图2.扫描电镜的成像原理2.扫描电镜的成像原理电子枪接受、转变成光子放大、转换成电压信号电子束电磁透镜样品表面扫描线圈扫描线圈次级电子信号探测器光电倍增管显象管/荧光屏样品表面上相应点样品表面上相应点所发出的次级电子数所发出的次级电子数荧光点的亮度荧光点的亮度电子枪灯丝电子枪灯丝电磁电磁透镜透镜探测器探测器电磁电磁透镜透镜扫描线圈的扫描线圈的束偏转器束偏转器样品托样品托样品样品显象管显象管次级电子次级电子扫描电镜成像原理的简单图示扫描电镜成像原理的简单图示(1)扫描电镜所用样品的制备方法简便(固定、干燥和喷金),不需经过超薄切片;(2)扫描电镜采用的是次级电子成像;(3)扫描电镜所观察到图像景深长,图像富有立体感;(4)图像的放大倍率在很大范围内连续可变(101~105×);(5)样品的辐射损伤及污染程度小等。扫描电镜在结构和工作原理上的特点:扫描电镜在结构和工作原理上的特点:(1)分辨率还不够高(1~10nm);(2)只能显示样品的表面形貌,无法显示内部详细结构。可观察到样品的内部结构;可观察到富有立体感的图像;提高了分辨率。扫描电镜的局限性:扫描电镜的局限性:冰冻蚀刻技术(freezeetching):冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术(freezeetching)(freezeetching)::利用“复膜(replica)”在透射电镜下观察:扫描电镜照片演示扫描电镜照片演示人耳听毛细胞的扫描电镜照片人耳听毛细胞的扫描电镜照片扫扫描描电电镜镜照照片片演演示示人人RBCRBC的扫描电镜照片的扫描电镜照片有被小泡的扫描电镜照片有被小泡的扫描电镜照片转转化化细细胞胞扫扫描描电电镜镜照照片片演演示示细胞褶皱的扫描电镜照片细胞褶皱的扫描电镜照片分裂沟的扫描电镜照片分裂沟的扫描电镜照片扫扫描描电电镜镜照照片片演演示示冰冻蚀刻电镜照片演示冰冻蚀刻电镜照片演示细胞质膜的冰冻蚀刻电镜照片细胞质膜的冰冻蚀刻电镜照片冰冰冻冻蚀蚀刻刻电电镜镜照照片片演演示示核膜核膜紧密连结的冰冻蚀刻电镜照片紧密连结的冰冻蚀刻电镜照片微绒毛的冰冻蚀刻电镜照片微绒毛的冰冻蚀刻电镜照片连结子连结子基膜基膜冰冰冻冻蚀蚀刻刻电电镜镜照照片片演演示示