秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析

秀丽隐杆线虫中RNA干扰作用的遗传分析姓名摘要：秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。本次实验通过饲喂的方法，观察外源RNA分子对秀丽隐杆线虫发育的影响，从而了解RNA干扰的原理、特性及其应用。通过此次实验，我们达到了实验目的，取得了良好的实验效果。关键词：秀丽隐杆线虫、RNA干扰（RNAi）、饲喂法1．引言秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期大约为4d。秀丽隐杆线虫成体长1～1.5mm，体宽约70μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。从1965年开始，SydneyBrenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以0.2%的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系。秀丽隐杆线虫的生命周期很短，20℃仅需4d。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于30个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。从孵化到成体，线虫经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，在身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、21.5、29.5和41h；身体长度分别是350、470、640和890μm。秀丽隐杆线虫孵化后约50h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA引起的转录后水平的基因沉默（PTGS）现象，是研究基因功能的一种快速和高通量的方法。目前，在线虫中发展出3种不同的RNAi实验操作方法：①注射（injection）dsRNA；②将线虫浸泡（soaking）于一定浓度的dsRNA溶液中；③用表达dsRNA的工程菌（E.coli）饲养（feeding）线虫。这3种方法各有优缺点，其中饲养法简单易行，适合高通量的基因功能筛选研究，已有用此方法对线虫全基因组进行筛选的报道。此次实验培养出RNAi型秀丽隐杆线虫的整体步骤是：提取秀丽隐杆线虫总RNA反转录合成cDNA，cDNA经过RT-PCR产生Gene，Gene经过双酶切产生Gene片段。另外L4440质粒双酶切形成线性L4440质粒。Gene片段与线性L4440质粒经过T4DNA连接酶连接形成L4440质粒-Gene，L4440质粒-Gene转入到E.coliHT115（DE3）中进行阳性克隆。阳性克隆后进行PCR鉴定。之后将阳性克隆产物进行IPTG诱导形成Gene-dsRNA，将其通过饲喂法导入到秀丽隐杆线虫，能产生对目的基因表达和功能的特异性干扰，从而培养出RNAi型秀丽隐杆线虫。2．材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：秀丽隐杆线虫野生型（N2）、大肠杆菌OP50、大肠杆菌HT115（DE3）、6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同genedsRNA的质粒，对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）实验试剂：LB液体培养基、NGM固体培养基实验器材：实体显微镜、显微镜、粘虫器（pick）、培养皿、锥形瓶、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、记号笔、酒精灯、火柴、高压蒸汽灭菌锅、封口膜2.2方法2.2.1活化大肠杆菌OP50打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其加入3mLLB液体培养基，再向其中加入300μL大肠杆菌OP50。将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12h）。2.2.2大肠杆菌OP50涂平板大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。用微量移液器取200μL菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口。将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养6～7小时。2.2.3向NGM培养基平板中接种线虫从老师提供的线虫培养板中选取有卵的或者L1、L2期雌雄同体线虫（生长时期保证一致），用粘虫器（pick）挑取这些线虫接种到NGM培养基平板中，用封口膜将平板封口。记录接种的线虫所处的生长时期和接种时间，根据线虫生长时期与温度的关系与自己的实际时间情况合理确定线虫培养方案，选择在不同温度的恒温培养箱（20℃和25℃）中的培养时间，将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）。2.2.4活化干扰菌株和涂干扰板在步骤2.2.3进行的期间，要进行活化干扰菌株和涂干扰板。打开超净工作台的紫外灯5min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取7个灭菌后的15mL离心管，用微量移液器向其中加入3mLLB液体培养基和3μLAmp，再分别加入300μLbli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2和lon6种干扰菌株以及阴性对照HT115菌株，用微量移液器吹吸混匀。将这7个15mL离心管做好标记，放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（12～16h）。之后取7个NGM培养基平板，在超净工作台中，用微量移液器分别取200～300μL7种活化好的菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开，用封口膜将平板封口，在平板的皿底和皿盖上同时做好标记。将干扰板置于37℃恒温培养箱中培养6～16小时。此步骤要求这7个干扰板接种的菌株培养好的时间与步骤2.2.3中将线虫培养至第四幼虫期（L4期线虫）的时间一致。2.2.5向7个干扰板中挑取L4期线虫步骤2.2.4中7个干扰板接种的菌株培养好后，步骤2.2.3中的线虫也培养至第四幼虫期（L4期线虫）。此时用粘虫器（pick）分别向7个干扰板中挑取10条L4期雌雄同体线虫，用封口膜将平板封口。挑取线虫后将干扰板置于20℃恒温培养箱中培养2d。2.2.6挑取4～5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中2d后挑取4～5条L4期雌雄同体线虫到新的干扰板中，用封口膜将平板封口。与原干扰板共同置于20℃恒温培养箱中培养5d。2.2.7观察两个干扰板中的后代表型，统计突变型出现的频率3．结果此次实验中使用了6种不同的RNA干扰菌株HT115（含有能表达不同genedsRNA的质粒），对应的性状编号分别为：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon。同时还使用了起阴性对照作用的RNA干扰菌株HT115，即转入了RNA干扰质粒空载体L4440的HT115。（1）接种了RNA干扰菌株HT115的平板起阴性对照的作用，线虫不发生突变。如图一所示。图一中的线虫都是雌雄同体线虫，个体比雄虫稍大，产卵器位于身体的中部，体内可见卵或胚胎。图二是在10×低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫。（2）接种了bli-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫身上表皮起泡（尤其是头部），线虫比野生型稍小。如图三所示。图二10×低倍镜下观察的HT115阴性对照线虫图一阴性对照的平板中线虫不发生突变图三中可以很明显地观察到突变线虫头部表皮起泡。（3）接种了dpy-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬，幼虫正常。如图四所示。图四中可以很明显地观察到突变线虫粗短，身体向左转弯，身体僵硬。（4）接种了dpy-5干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是成虫非常粗短，幼虫正常。如图五所示。图五中“A”是突变线虫，“B”是未突变线虫（即野生型线虫）。二者对比可以很明显地看出突变性状。图六是在10×低倍镜下观察接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫。图六中“A”是未突变线虫（即野生型线虫），“B”和“C”是突变线虫。二者对比可以很明显地看出突变性状。（5）接种了him干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是在干扰板中雄虫出现率提高。如图七所示。A图六10×低倍镜下接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫BC图五接种dpy-5干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫AB图四接种dpy-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图三接种bli-2干扰菌株的干扰板中突变线虫图七中“A”和“B”是雄虫，“C”、“D”和“E”是雌雄同体线虫。雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器呈扇形（三角形）。不过虽然接种了him干扰菌株的干扰板中雄虫出现率提高，但是雄虫出现的频率仍然较低。图八是在10×低倍镜下观察接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫。图八中“A”是雄虫，“B”、“C”和“D”是雌雄同体线虫。图中可以很明显地看出雄虫比雌雄同体线虫身体细、颜色浅，尾部的交配器由于被雌雄同体线虫挡住无法观察到扇形（三角形）。还可以看到雄虫体内的消化管和储精管。（6）接种了sma-2干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫比野生型短小。如图九所示。图八10×低倍镜下观察接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫ABCDABCDE图七接种him干扰菌株的干扰板中雄虫和雌雄同体线虫实验中发现，突变线虫比野生型线虫短小的性状并不明显，较难观察。图九中“A”（突变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状。（7）接种了lon干扰菌株的干扰板中，线虫可以发生性状突变，突变特征是线虫各个发育阶段均较野生型长，头部和尾部变尖。如图十所示。实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。图十中“A”（突变线虫）和“B”（未突变线虫）两只线虫对比可以较清楚地观察出突变性状。图十一是在10×低倍镜下观察接种lon干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫。图十接种lon干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫AB图九接种sma-2干扰菌株的干扰板中突变线虫和未突变线虫AB实验中发现，突变线虫比野生型线虫长的性状并不明显，较难观察。图十一中“A”（突变线虫）和“B”、“C”（未突变线虫）的对比可以较清楚地观察出突变性状。4．讨论RNAi是一个奇特的生物现象，在许多物种中特殊的dsRNA的表达会导致相应的mRNA降解使得该基因的功能几乎完全丧失。应用这项技术可以方便的找出突变的表型而不必去费力的分离一个突变的基因本从而大大加快了研究的进程。RNA干扰机制是如下所示：第一步（起始阶段），dsRNA在内切核酸酶（Dicer酶）作用下加工裂解形成21～23nt的siRNA；第二步（效应阶段），是由siRNA中的反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体（RNAinducedsilencingcomplex，RISC），由RISC介导切割靶向mRNA分子中与siRNA互补的区域，从而达到干扰基因表达的作用。秀丽隐杆线虫的RNAi方法有显微注射法、浸泡法和饲喂法。显微注射法是最初的RNA干扰试验采用的经典方法，是通过直接注射dsRNA到雌雄同体线虫的生殖器官，然后检查它亲代以及后代的表型。它的不足之处在于效率低，不适合用此法进行高通量筛选，同时干扰效果会随着细胞分裂而不断降低，不适合进行晚期表达基因研究。浸泡法是将线虫浸泡在dsRNA溶液中，但是干扰成功率不高。饲喂法是给线虫饲喂表达dsRNA的大肠杆菌，从而产生RNA干扰效果，该方法成功率近似