第十四章-基因工程制药工艺

第一节基因工程制药微生物表达系统第二节基因工程大肠杆菌的构建技术第三节基因工程菌的发酵培养与控制第十四章基因工程制药工艺获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装第一节基因工程制药微生物表达系统14.1.1大肠杆菌表达系统14.1.2酵母表达系统基因工程制药微生物表达系统基因工程制药微生物表达系统基因工程菌：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：大肠杆菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。主要是生产重组蛋白质类药物细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛、无芽孢、一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。1、大肠杆菌形态特征14.1.1大肠杆菌表达系统基因工程制药微生物表达系统能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。2、生化与遗传特性基因工程制药微生物表达系统3、质粒载体复制子选择标记多克隆位点基因工程制药微生物表达系统首字母：大写：细菌属名2-3字母：小写：细菌种名如EcoR14:大写:菌株1，2…:分离到酶的次序质粒载体的基本特征自主复制性：复制子：复制起始点及控制复制频率的调控元件。质粒不依赖于染色体DNA而自主复制选择性标记：质粒编码的选择标记，产生一种新的表型，用于转化体的筛选。抗生素抗性基因，氨苄、四环素、卡那霉素等多克隆位点：是外源基因插入载体的位置，有多种常见的限制性内切酶位点序列构成不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一宿主细胞内转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞/菌。基因工程制药微生物表达系统质粒类型严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：用于基因测序。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物基因工程制药微生物表达系统4、产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。基因工程制药微生物表达系统一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。5、优缺点发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。基因工程制药微生物表达系统6、应用大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。多肽类2种（甲状旁腺激素、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类：5种干扰素α、干扰素β和γ，2种G-CSF，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：r-PA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。基因工程制药微生物表达系统14.1.2酵母表达系统1、形态特征细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。基因工程制药微生物表达系统2、生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因基因工程制药微生物表达系统3、表达载体含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动、终止子和信号肽序列构成的表达盒序列。四种类型：YIp酵母整合载体YCp酵母着丝粒载体YRp酵母复制载体YEp酵母附加载体基因工程制药微生物表达系统4、优缺点优点：五种类型的载体，——安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。基因工程制药微生物表达系统5、应用1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等。8种产品基因工程制药微生物表达系统第一节基因工程制药微生物表达系统第二节基因工程大肠杆菌的构建技术第三节基因工程菌的发酵培养与控制第十四章基因工程制药工艺基因工程制药基因工程技术-基因重组示意图DNA片段酶切、连接，形成重组DNA分子导入宿主细胞系统中扩增目标基因表达，生成新产物，出现新性状。大肠杆菌的构建技术第二节基因工程大肠杆菌的构建技术14.2.1构建流程14.2.2目标基因的克隆14.2.3表达载体构建14.2.4工程菌构建基因工程制药大肠杆菌的构建技术14.2.1构建流程目标基因克隆研究内容研究方法PCR，文库，化学合成表达载体构建遗传转化与筛选工程菌酶切，连接外源基因导入与培养新性状、功能、物质基因工程制药大肠杆菌的构建技术14.2.2目标基因的克隆目标基因：是编码目标蛋白质或多肽的DNA序列。正确克隆的重要性：只要有一个碱基发生突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学的活性。基因工程制药大肠杆菌的构建技术RT-PCR克隆目标基因流程反转录：起始原料RNAPCR：起始原料DNA基因工程制药大肠杆菌的构建技术反转录反应的操作样品变性：75℃水浴5min，冰冷，引物与mRNA配对反转录：反转录酶42℃或37℃，cDNA第一链，1h终止反应：使反转录酶失活，95℃加热5min反转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，以RNA为模板，dNTP为底物，以DNA为引物，合成与RNA互补的DNA基因工程制药大肠杆菌的构建技术引物引物最好在模板cDNA的保守区内引物长度一般在15~30碱基之间引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃引物3′端要避开密码子的第3位引物自身及引物之间不应存在互补序列引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。基因工程制药大肠杆菌的构建技术1、PCR扩增（1）PCR技术PCR(Polymerasechainreaction)聚合酶链式反应：在DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进行的复制反应本质：生物体DNA复制原理在体外合成DNA发明者：Mullis，生物技术革命的象征，1993年获得诺贝尔奖基因工程制药大肠杆菌的构建技术在引物的指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列的聚合延伸形成互补序列的反应5′—3′聚合反应PCR基因工程制药大肠杆菌的构建技术基因工程制药大肠杆菌的构建技术变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C（2）PCR单反应原理与过程打开双链，形成单链引物与模板结合形成新的双链（2）PCR单反应原理与过程(1)变性(94℃)(2)退火(55℃)(4)完成一个循环(3)延伸(72℃)基因工程制药大肠杆菌的构建技术（3）PCR循环基因工程制药大肠杆菌的构建技术（4）PCR扩增反应体系组成成分浓度用量作用缓冲液10×5mL提供反应环境dNTPs20mmol/L1mL反应的底物正向引物20mmol/L2.5mL扩增的起始点反向引物20mmol/L2.5mL扩增的终止点DNA聚合酶1～5U/mL1～2mL催化，热稳定MgCl21～5mmol/L1mL辅酶模板DNA5～10mL含目标基因序列H2O27～33mL稀释总体积50mL基因工程制药大肠杆菌的构建技术（5）PCR扩增产物反应变性退火聚合循环数第一个反应94℃，5min1第二个反应94℃，30s55℃，30s72℃，1min30-35第三个反应94℃，1min55℃，30s94℃，7-10min1基因工程制药大肠杆菌的构建技术概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液，限制性内切酶。反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。电泳检查：酶切完全性。2、酶切反应基因工程制药大肠杆菌的构建技术粘性末端平头末端基因工程制药大肠杆菌的构建技术3、连接反应概念：DNA双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。连接反应：16℃-26℃，数小时，或过夜。终止反应：在70℃加热10分钟。基因工程制药大肠杆菌的构建技术基因工程制药大肠杆菌的构建技术4、转化转化：把外源基因导入宿主细胞的过程；某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象基因工程制药大肠杆菌的构建技术大肠杆菌转化——CaCl2法感受态细胞制备：将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下离心10分钟。弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下，离心10分钟。加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。热击：42℃，90s；置冰上，1－2分钟。扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。筛选培养：37℃，出现菌落。基因工程制药大肠杆菌的构建技术感受态细胞制备：E.coli经Cacl2处理（0～5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。5、筛选与鉴定非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）非目标重组子：不含目的基因重组子转化后的细胞类型基因工程制药大肠杆菌的构建技术（1）筛选方法抗生素筛选法：抗生素的抗性基因，氨苄青霉素。基因工程制药大肠杆菌的构建技术（1）筛选方法基因工程制药大肠杆菌的构建技术培养基中含X-galX-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷β-半乳糖苷酶可以把培养基中无色的X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落成蓝色抗生素筛选法：篮白斑筛选法：lacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。（1）筛选方法基因工程制药大肠杆菌的构建技术若LacZ基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。（2）鉴定方法菌落PCR：含有目标基因载体大小：电泳检测酶切鉴定：目标基因插入及插入方向测序确证：目标基因的序列准确无误基因工程制药大肠杆菌的构建技术14.2.3表达载体构建表达载体概念：在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒(操纵子模型)：目标基因启动子终止子基因工程制药大