第2章细胞分离与破碎

第二章细胞分离与破碎BIoseparatIonEngIneerIng本章节重点：离心沉降公式的推导及应用；离心设备的分类及工作原理；细胞破碎一般方法及原理。BIoseparatIonEngIneerIng通过微生物发酵或动植物细胞培养得到的原料液，应首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。如果目标产物为胞外物，可直接利用培养液进行以后的分离纯化操作；如果目标产物为胞内物，则要对菌体或细胞进行适当的处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片，再进行目标产物的分离纯化。本章介绍细胞分离、目标产物释放以及蛋白质复性的主要方法和原理。概述BIoseparatIonEngIneerIng1.1重力沉降重力沉降在化工操作过程中常用的气-固、液-固和液-液分离手段，在生物分离过程中亦有较多的应用1细胞分离BIoseparatIonEngIneerIng以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受到重力、浮力和阻力的作用。3PS16gFdg3bPL16Fdg2222LgPLgPS×248vdvdFζζ阻力浮力重力BIoseparatIonEngIneerIng1.滞留区：stokes方程10-4Re1沉降速度2.过渡区：Allen公式1Re103沉降速度3湍流区：Newton公式103Re2×105沉降速度2PSLL()18gdgv0.60.5PSLL()0.27[]gdgvRe0.5PSLL()1.74[]gdgvBIoseparatIonEngIneerIng一般而言单体细胞直径小、沉降速度很低，满足10-4Re1，可使用公式计算当颗粒浓度较大时，颗粒之间相互碰撞相干扰，影响沉降速度。此时，颗粒的沉降速度比单一颗粒小，需用空隙率函数f(ε):校正为悬浮液的空隙率4.65()εfε'1()ggvvfε2PSLL()18gdgvBIoseparatIonEngIneerIng菌体和动植物细胞的重力沉降虽然简便易行，但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。因此，实用上需使菌体细胞凝聚成较大颗粒后进行沉降操作，提高沉降速度。在中性盐的作用下，可使菌体表面双电层排斥电位降低，有利于菌体之间产生凝聚。BIoseparatIonEngIneerIng另外，向含菌体的料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂，可使菌体之间产生架桥作用而形成较大的凝聚颗粒。凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降，而且还可以在过滤分离中大大提高过滤速度和质量。当培养液中含有蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而同时过滤除去。BIoseparatIonEngIneerIng1.2离心沉降离心沉降是科学研究与生产实践中最广泛使用的非均相分离手段，不仅适用于菌体和细胞的回收或除去，而且可用于血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分离．也广泛应用于液---液相分离。BIoseparatIonEngIneerIng1.2.1离心沉降速度单位质量的物质所受到的离心力为：其中N为转速，r为离心机半径离心设备的一个重要技术指标是：所能达到的离心力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量离心程度的参数r用z表示：BIoseparatIonEngIneerIng注意：科技文献中常将离心操作的条件用多少g(如5000g、8000g等)表示．就是将离心力用Zg形式表达的。将stokes公式中的g用Zg代替，得到离心沉降速度vs公式：或者：222PSLL2()N9sdrvBIoseparatIonEngIneerIng需要注意的一个公式：室温下（20℃）某物质在水中的沉降系数：一些蛋白质的沉降系数表0W,20W,201SSkcBIoseparatIonEngIneerIng1.2.2离心分离法（1）差速离心分级差速离心(Differentialcentrifugation)是生物化工最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分组分离。BIoseparatIonEngIneerIng一些菌体细胞的大小和离心操作条件BIoseparatIonEngIneerIngBIoseparatIonEngIneerIng(2)区带离心区带离心是生化工程中的重要分离手段，根据离心操作条件不同，又分差速区带离心和平衡区带离心。两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质(如蔗糖溶液）调配好密度梯废，在密度梯度之上加待处理的料液进行离心操作。两者的区别在于溶质的密度梯度中的与待分离物质的密度梯度不一样。BIoseparatIonEngIneerIng区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。20世纪60年代人们开发了区带转子，利用其代替离心管，可增加处理能力。BIoseparatIonEngIneerIng1.2.3.离心分离设备实验室一般用转子离心机。按速度分为低速离心机、高速离心机、超离心机。BIoseparatIonEngIneerIng工业离心分离设备中，较为常用的有管式和碟片式两大类.管式离心机工作原理：在离心力作用下．管内液面旋转轴为中心圆筒，将轻相（清液）和重相分离开来。缺点是沉降面积小．处理能力较低。BIoseparatIonEngIneerIng一般管式离心机的工作参数：BIoseparatIonEngIneerIng碟片式离心机又称板式离心机，离心转子中有许多等间隔的碟型分离板，以增大沉降面积和提高处理能力。操作过程，料液从中心进料口输入，通过转子底部的液孔进入分离板外径处，进入分离板的间隙。通过分离板的间隙向转子中心移动过程中，重相受离心力作用而沉降，轻相从转子上部出口排出。连续操作时，重相从喷嘴连续喷出。碟片式离心机结构复杂，离心转数一般较管式离心机低。BIoseparatIonEngIneerIng碟片式离心机工作示意图BIoseparatIonEngIneerIngBIoseparatIonEngIneerIng碟式离心机是立式离心机的一种，转鼓装在立轴上端，通过传动装置由电动机驱动而高速旋转。转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件--碟片。碟片与碟片之间留有很小的间隙。悬浮液（或乳浊液）由位于转鼓中心的进料管加入转鼓。当悬浮液（或乳浊液）流过碟片之间的间隙时，固体颗粒（或液滴）在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液层）。沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转鼓。碟片的作用是缩短固体颗粒（或液滴）的沉降距离、扩大转鼓的沉降面积，转鼓中由于安装了碟片而大大提高了分离机的生产能力。积聚在转鼓内的固体在分离机停机后拆开转鼓由人工清除，或通过排渣机构在不停机的情况下从转鼓中排出。BIoseparatIonEngIneerIng主要特点1）分离能力强，分离因数在5000-9500之间；2）生产能力大，最高达10米3/小时；3）机动性强，根据需要可以自动或手动操作，也可以实现远距离自动操作；4）维修方便主要用途主要适用于固形物在1-15%之间，固相颗粒直径大于0.5微米的液-液-固分离。例如油类：植物油、动物油、鱼油、乳油、原油、各种原料油、生物柴油、煤焦油、润滑油的分离、澄清：乳品的澄清；BIoseparatIonEngIneerIng利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法过滤是一种膜分离法1.3过滤BIoseparatIonEngIneerIng滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介质表面堆积的滤饼滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素提高过滤速度方法：1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）BIoseparatIonEngIneerIng2细胞破碎概述：许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外的培养液中，而保留在细胞内。这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细胞后，进行细胞破碎(celldisruption)，使目标产物选择性地释放到液相中。破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离方法(主要是离心法)除去后，上清液用于进一步的分离纯化。BIoseparatIonEngIneerIng1）细胞壁动物、植物和微生物细胞结构差异革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间差异细菌与真菌间差异2.1细胞结构BIoseparatIonEngIneerIng细胞膜结构2）细胞膜BIoseparatIonEngIneerIng磷脂分子由疏水和亲水基团组成。疏水基团尾部有两烷基基团，亲水基团头部有两性基团，或者说是醇基，在内膜层中，磷脂的尾部聚集在一起，头部暴露在水中，形成磷脂双分子层。BIoseparatIonEngIneerIng原核细胞：细胞质、核糖体真核细胞：细胞核、细胞质、细胞器3）细胞质BIoseparatIonEngIneerIng生物产物存在地：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞器破碎目的：破坏或破碎细胞壁和细胞膜，释放其中目标产物2.2细胞破碎和产物释放原理BIoseparatIonEngIneerIng机理机械破碎法：压缩力和剪切力破坏细胞壁和细胞膜结构化学破碎法：1)改变细胞壁或膜结构，增大胞内物质溶解速率2)完全溶解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质BIoseparatIonEngIneerIng2.3细胞破碎技术2.3.1机械破碎（1）高压匀浆（高压剪切破碎）影响因素：压力、循环操作次数和温度适用于酵母和大多数细菌细胞团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞需要安装冷却装置BIoseparatIonEngIneerIng（2）珠磨填充物为玻璃和氧化锆（粒径0.1~1.0mm）破碎效率岁搅拌速度和悬浮液停留时间增大而增大微珠粒径于目标细胞的直径比为30~100适用于大多数微生物细胞，优化设计过程复杂WSK卧式高效全能珠磨机ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机BIoseparatIonEngIneerIng（3）喷雾撞击破碎细胞破碎仅发生在与撞击板撞击一瞬间，细胞破碎程度均匀，破碎程度可以通过无极调节载气压力控制，避免细胞内部结构破坏适用于大多数微生物细胞和植物细胞BIoseparatIonEngIneerIng（4）超声波破碎超声波作用下液体发生空化作用破碎程度于细胞种类、浓度、超声波声频、声能有关强烈的破碎作用，适用于大多数微生物细胞能量利用率低，过程产生大量热声波的传递依照正弦曲线纵向传播，即一层强一层弱，依次传递，当弱的声波信号作用于液体中时，会对液体产生一定的负压，即液体体积增加，液体中分子空隙加大，形成许许多多微小的气泡，而当强的声波信号作用于液体时，则会对液体产生一定的正压，即液体体积被压缩减小，液体中形成的微小气泡被压碎。经研究证明：超声波作用于液体中时，液体中每个气泡的破裂会产生能量极大的冲击波，相当于瞬间产生几百度的高温和高达上千个大气压，这种现象被称之为---”空化作用”，BIoseparatIonEngIneerIng方法技术原理效果成本举例机械法高压匀浆细胞被搅拌器劈碎适中适中酵母和大多数细菌珠磨破碎细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理喷雾撞击细胞高速冻结，撞击撞击板，发生破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理超声波用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理BIoseparatIonEngIneerIng方法技术原理效果成本举例化学法酸碱处理调节pH改变贺电性质，使蛋白质间作用力降低剧烈便宜化学试剂处理表面活性剂、螯合剂、盐、有机溶剂处理，增大细胞壁通透性；变性剂破坏氢键作用剧烈适中脲、盐酸胍用于细菌细胞酶溶细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵甘露糖酶处理酵母细胞2.3.2化学和生物化学渗透BIoseparatIonEngIneerIng碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且