微生物工程实验指导

微生物工程实验指导河北农业大学生命科学学院制药工程系2007年10月实验一细菌生长曲线的测定一、实验目的了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用比浊法测定细菌的生长曲线。二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。三、实验材料1.菌种大肠杆菌（E.coli）2.培养基肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，调pH7.0-7.2。3.仪器和器具721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。四、流程种子液→标记→接种→培养→测定五、实验方法1.种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。2.标记编号取盛有50mL（5mL）无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶（18×180试管）11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。3.接种培养用2mL（1mL）无菌吸管分别准确吸取2mL（0.2mL）种子液加入已编号的11个三角瓶（试管）中（可早、晚各接种一次，则均在白天取样，次日下午或晚上可测），于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将三角瓶（试管）取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD600值。4.生长量测定将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10-0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。六、结果1.将测定的OD值填入下表：时间(h)对照01.534681012141620OD60002.以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。实验二从土壤中分离产酸细菌一.实验目的要求：掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基制备原理和方法。二.实验原理：从混杂的微生物群体中获得某一种或某一株微生物的过程，称微生物的分离与纯化，本实验采用稀释涂布平板法分离产酸细菌，以碳酸钙为底物，经产酸菌酸化形成透明圈。2H++CO32-→CO2↑+H2O三.主要设备、器材：1.实验器皿：250mL三角瓶2只；试管7支（带棉或硅胶塞）；9cm培养皿6个；1mL移液管7根；吸耳球1个；涂布棒3个；废报纸、棉花、棉绳、玻璃珠若干。净工作台、接种环、酒精灯各一套2.实验试剂：琼脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3，0.5mol/L的HCl溶液，0.5mol/L的NaOH溶液，玻璃棒，pH试纸四实验步骤：1.分离用器皿的准备用报纸包扎6个培养皿，7根1mL移液管，3个涂布棒，160℃干热灭菌60min。（亦可121℃湿热灭菌20min）2.无菌水的制备取1只250mL三角瓶装入90mL自来水和15-20粒玻璃珠。121℃湿热灭菌20min。取6支试管各加自来水9mL(6只一捆)。121℃湿热灭菌20min。3.培养基的制备及分离平板制作取1只250mL三角瓶制作细菌固体培养基100mL（配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO31%，琼脂1.8-2.0%，pH7.0），121℃湿热灭菌20min，60℃恒温箱保温。倒平板，将培养基充分摇匀呈浑浊液，立即在超静台上将6个培养皿倒入细菌培养基（约15-16mL）。4.土壤中产酸细菌的分离操作称取校园土10g，在超静台无菌操作倒入冷却至室温的无菌水中（90mL蒸馏水/250mL三角瓶带玻璃珠），摇匀5-10min，制成菌液，用十倍稀释法稀释到10-6（5支无菌水试管）。分别取10-4，10-5，10-6稀释度的稀释液，每个稀释度涂布两个培养皿，每个培养皿0.1mL（2-3滴）。35℃培养箱培养2d，观察单菌落周围有无透明圈出现。如有透明圈说明该菌株可能产酸。（以下内容选作）挑取具有透明圈的单菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，进一步利用划线分离法纯化，做产酸能力实验。从复筛培养基上挑取透明圈较大的单菌落接种至三角瓶液体培养基中，摇床培养2天后，检测产酸能力（用pH试纸或酸碱滴定法）。五根据实验结果进行分析讨论六思考题:1.根据实验结果回答，如何区分平板中非产酸菌？2.你觉得本实验设计的筛选培养基该如何改进？实验二喷雾干燥酶粉中分离筛选1398中性蛋白酶生产菌株（选做）一、实验目的要求掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术。二、实验原理中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。比值大的其产酶活力明显增大。三、材料与方法1、试验材料供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。购自市场。2、培养基（1）干酪素培养基：干酪素2.0％（用适量NaOH溶液加热溶解），琼脂1.5％，pH7.0（或干酪素4g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，1000mL）。（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.4％，蛋白胨0.6％，酵母浸出粉0.2％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，pH7.0（3）发酵培养基Ⅰ：麸皮4.0％，蛋白胨0.1％，Na2HPO4·12H2O0.4％，KH2PO40.03%，pH7.0。发酵培养基Ⅱ：可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.5％，Na2HPO4·12H2O0.4%，KH2PO40.03%，CaCl20.1%，pH7.0。3、仪器与设备超净工作台，恒温培养箱，恒温振荡培养箱，恒温水浴锅，台式低速离心机，721型分光光度计4、步骤（1）初筛利用样品通过常规稀释平板法：即取10g样品置于已加入90mL无菌水的三角瓶中，220r／min旋转摇床，20min后取出，静置30s。此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9mL无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。将干酪素培养基分别倒入已灭菌的6个平皿中，每个平皿倒入10mL左右，然后吸取0.1mL的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。37℃培养24h。肉眼选出产生透明圈的菌株。将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。37℃培养24h。取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37℃培养24h。（2）复筛面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基Ⅰ的三角瓶中进行发酵培养。30℃恒温振荡培养48h，3500r／min离心30min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。用发酵培养基Ⅱ进行发酵培养，30℃恒温振荡培养48h，3500r／min离心30min，取上清液测蛋白酶活力。然后从中挑选出酶活力最高的1株。5、蛋白酶活力的测定（1）原理采用福林-酚试剂法。福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。（2）试剂福林-酚试剂在2000mL磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700mL蒸馏水，再加50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入50g硫酸锂（Li2SO4），50mL蒸馏水及数滴浓溴水（99％），开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加浓溴水的步骤）。定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液。2%酪蛋白溶液准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。100μg/mL酪氨酸溶液精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，用1mol／L盐酸溶液60mL溶解后，用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg／mL酪氨酸标准溶液10mL，用0.1mol／L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的酪氨酸标准溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。（3）酪氨酸标准曲线的绘制取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按下表分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4moL/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0μg/mL酪氨酸反位液做空白对照。管号标准酪氨酸(mL)去离子水(mL)Na2CO3(mL)福林一酚试剂(mL)酪氨酸含量(μg/mL)101.051020.20.8512030.40.6514040.60.4516050.80.2518061.0051100（4）样品酶活力的测定取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL，1号管立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入1mLpH7.2、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4moL/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。（5）蛋白酶活力计算：蛋白酶活力=A×4×N/10。式中：A表示对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；4表示反应液总体积；N表示酶液的稀释倍数；10表示反应时