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高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日课题研究计划书项目名称:甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究项目负责人:颜元良项目执行人:黄琪实施时间:2018.08-2020.08高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究方案摘要目的：本课题的研究目的是通过检测接受大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的患儿的MTHER、ABCB1、SLC19A1等基因多态性，了解在汉族儿童中位点的突变频率，研究基因多态性位点对ALL患儿使用HD-MTX治疗后疗效和不良反应发生的关系，进而为个体化甲氨蝶呤（MTX）治疗ALL患儿提供依据，减少HD-MTX治疗过程中出现的严重不良反应。方法：根据分组标准分别收集200例2018年8月至2019年1月中南大学湘雅医院的接受HD-MTX化疗治疗后24小时、48小时的ALL患儿外周血，用多重PCR-SNP技术检测患儿MTHER、ABCB1及SLC19A1等基因型，同时观察接受HD-MTX化疗治疗的ALL患儿发生的不良反应。高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究一、研究背景急性白血病（Acuteleukemia,AL）是儿童时期最常见的恶性肿瘤，而急性淋巴细胞白血病（Acutelymphoblasticleukemia,ALL）占其中的70%，在儿童恶性肿瘤的死亡率中AL居首位，严重危害儿童的健康。甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）是一种重要化疗药物，HD-MTX是ALL患儿达到完全缓解后的主要巩固及维持化疗方案，而MTX是一种叶酸拮抗剂，通过结合二氢叶酸还原酶，使四氢叶酸生成障碍来干扰DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞增殖。HD-MTX化疗可引起多种毒副反应，主要有骨髓抑制，表现为白细胞减少，严重时可有全血抑制，胃肠道反应除常见的恶心、呕吐等，还有口腔、肛周等黏膜溃疡。大剂量或长期应用时可使肝肾功能受损。而化疗药物引起的不良反应致化疗暂停或终止，使得急性淋巴细胞白血病复发和死亡增加，影响疾病结果。同时，我们临床上发现，接受同样剂量的甲氨蝶呤化疗治疗的患儿发生毒副反应不同，造成这一结果有很多种原因，但基因多态性是其中一个关键因素。药物基因组学研究显示，与药物转运、代谢、作用靶点相关基因的单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）是决定药物疗效和不良反应的关键因素之一。故叶酸代谢途径、甲氨蝶呤在人体内代谢需要的酶、转运体的基因多态性值得重视。亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR）是叶酸代谢途径的限速酶之一，可以将5,10-二甲基四氢叶酸催化还原为5-甲基四氢叶酸，对于DNA的合成、活化及修复起着关键的调控作用；另外，甲氨蝶呤转运体主要有两类：三磷酸腺苷结合盒转运体（ATP－bindingcassette,ABC转运体）和溶质蛋白转运体家族（Solutioncarrier,SLC家族）。ABCB1基因是多种肿瘤发生耐药的主要原因，也是目前转运体家族里研究的比较多的基因。由于该基因编码的P－gp(P－糖蛋白)属于糖基化膜蛋白，依赖于ATP供能，可将药物逆浓度梯度排出在细胞外。该蛋白分布于人体内的肠、肝、肾及脑组织。SLC19A1又称为还原性叶酸载体(RFC)，是MTX进入细胞的主要转运体之一，SLC19A1的变异可能会影响MTX进入细胞的总量，从而影响MTX的血药浓度、药物不良反应（ADR）或疗效。高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日本研究主要通过收集200例2018年8月至2019年1月中南大学湘雅医院的ALL患儿外周血，检测HD-MTX化疗治疗后24小时、48小时MTX血药浓度，检测MTHFR、ABCB1及SLC19A1等基因位点多态性，观察接受HDMTX的ALL患儿出现MTX毒副反应，比较两者之间的关系，为个体化MTX治疗ALL患儿提供依据，减少HDMTX化疗治疗过程中出现的严重毒副反应。二、研究目的考察中国汉族儿童中MTHER、ABCB1、SLC19A1等基因位点的突变频率，研究基因多态性位点对ALL患儿使用HD-MTX治疗后疗效和不良反应发生的关系。三、研究方法3.1病例收集3.1.1入选标准：1)在中南大学湘雅医院小儿血液专科住院，进行了完整HD-MTX治疗的儿童ALL病例，均经骨髓细胞形态学检查确诊。根据CCLG-ALL-2015方案危险度分组，在细胞形态学-免疫学-细胞遗传学-分子生物学（Morphology-Immunology-Cytogenetics-Molecular，MICM）分型基础上，结合其他临床生物学特点中和同预后确切相关的危险因素，进行临床危险度分型：标危（Standardrisk，SR），中危（Intermediaterisk，IR），高危（Highrisk，HR）；免疫分型：200例患儿均进行免疫分型，根据流式细胞技术分型结果，患儿可分为B-ALL和T-ALL。2)年龄在1月-14岁；3)汉族4)签署知情同意书。3.1.2排除标准：具有以下一条者，均排除在试验之外：1)其他少数民族患儿；高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日2)合并其他类型血液疾病；3)合并有严重肝、肾功能疾病及胃肠道功能紊乱、粘膜炎等疾病患儿4)继发性免疫缺陷病者；5)入组前1月到1周期间使用糖皮质激素大于等于7天，或前3个月内有任何化疗、放疗史者（为解除压迫症状而采取的紧急放疗不在除外之列）；6)不愿意参加本研究者。3.1.3临床资料的采集1)基本资料：病案号、病区、床号、姓名、性别、民族、出生年月（年龄）、身高、体重、BMI；2)相关理化检查指标结果：①全血像、外周血肿瘤细胞计数；②肝、肾功能（尿酸）、EKG检查、血清铁蛋白、血清LDH、电解质；③骨髓涂片：细胞学和细胞组织化学。3.2分组标准：低危组中危组高危组1.必要条件（B-ALL满足以下条件之一）①年龄≥365天，但≤9.9岁，且WBC≤50×109/L②染色体≥50或DNA指数≥1.16③TEL-AML1融合基因型2.必须除外下列情况①CNS3和/或睾丸白血病②t（1；19），t（9；22），MLLr、染色体＜44、jAMP21③第19天MRD≥1%1.Ph+ALL2.T-ALL3.MLLr：年龄≥6月或WBC＜300×109/L4.染色体数＜445.其它所有不符合低危和高危组的ALL1.第46天MRD≥1%2.MLLr-ALL：年龄＜6月，且WBC≥300×109/L3.3统计学方法高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日使用SPSS19.0进行数据的统计分析。计量资料采用Mean±SD表示，t检验或方差分析；计数资料采用卡方检验或精确概率法；p＜0.05为差异有统计学意义。可信区间采用双尾。3.4试验方法3.4.1DNA提取经我院医学伦理委员会审批并征得患儿监护人的知情同意，根据分组标准收集200例接受HD-MTX化疗治疗后24小时、48小时的ALL患儿的全血标本分别2ml于含抗凝剂的采血管中。使用TIANampBloodDNAMidiKit试剂盒提取DNA。TIANampBloodDNAMidiKit1）向15ml离心管加入200ulProteinaseK（20mg/ml）溶液；2）处理材料：直接加入2ml血液样本，混匀；3）向装有血液样本的离心管加入2.4ml缓冲液GE，振荡30sec混匀；4）65℃放置10min，每隔3min振荡一次，以助裂解。简短离心以收集管盖内壁的水珠（如遇特殊样本，未能很好裂解，请适当延长孵育时间）；5）向样本中加入2ml无水乙醇，混匀，此时可能出现絮状沉淀；6）将上一步所得溶液和絮状沉淀的一半转移至一个吸附柱CB5中（吸附柱放入15ml收集管中），3000rpm（～1850×g）离心3min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中；7）将步骤6剩余的溶液再转入同一个吸附柱中，重复步骤6操作；8）向吸附柱CB5中加入2ml缓冲液GD，5000rpm（～4500×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中；9）向吸附柱CB5中加入2ml缓冲液PW，5000rpm（～4500×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中；高剂量甲氨蝶呤在急性淋巴细胞白血病治疗的药物基因组学研究/第1.0版/日期：2018年08月02日10）向吸附柱CB5中加入2ml缓冲液PW，5000rpm（～4500×g）离心15min，丢弃收集管，将吸附柱CB5放到一个新的15ml离心管中；11）向吸附膜的中间部位悬空滴加300ul洗脱缓冲液TB，室温放置5min，5000rpm（～4500×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。3.4.2基因分型运用多重PCR-SNP技术对患儿MTHER、ABCB1及SLC19A1进行基因分型。