定量蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

定量蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术北京蛋白质组研究中心-生物质谱实验室郑兆彬2008-03-19定量蛋白质组学的主要技术策略基于凝胶电泳的策略2DE-DIGE：differencegelelectrophoresis-荧光染料(Cy2,Cy3,Cy5)-标记蛋白上的K的ε-氨基稳定同位素标记的策略cICAT:CleavableIsotopeCodedAffinityTags-标记含C的蛋白-只能定量含C的标记肽段－亲和富集标记肽段-MS水平上定量iTRAQ:IsotopeTaggingReagentsforRelativeandAbsoluteQuantificaton-多重标记（4or8plex)-标记肽段上K或N末端-标记所有肽段-MS/MS水平上定量肽段ratio。SILAC:StableIsotopeLabellingwithAminoAcidsinCellCulture–细胞培养在分别含轻链氨基酸和重链氨基酸的培养液/基中–MS水平上测定肽段轻重链的比值。胍基化乙酰化稳定同位素标记:肽段水平上标记-轻重链分别标记N端-标记所有肽段-MS水平上定量O18标记:在胰酶的催化作用下,羧基端的2个O16原子被交换成O18原子-标记所有肽段-MS水平上定量。(From)+protein@pH8.5FluorONHNHOlysineFluorNHSesteractivegroupice-waterbath荧光试剂(Cy2,3,5)与K反应2DE-DIGE流程图NHNHSONHOONHIXXXXXXXXOOBIOTINLINKERTHIOL-SPECIFICREACTIVEGROUP位置：X为个氢原子（D0）可被同位素氘（D8）,相差8DaICAT试剂的结构cICAT试剂的结构cICAT(ABI)在ICAT基础上做了一些改进,其同位素标签分别由9个12C和13C标记,这样由不同原子标记的cICAT分子量相差9Da。三部分组成：半胱氨酸特异性反应基团、含9个同位素12C或13C标签的可裂解连接子和亲和纯化的生物素部分.在同位素标签的连接子和亲和反应基团之间增加了一个酶解位点,在ICAT标记的肽段分离纯化后可以通过酸裂解将亲和反应基团生物素切去,裂解后的同位素标签的分子量只有227(236)Da.强阳离子交换柱分离状态1状态2用d(8)ICAT试剂标记用d(0)ICAT试剂标记合并蛋白质，用胰蛋白质酶酶解ICAT标记肽段的亲和纯化收集肽段，去除杂质反相液质联用分析MSMS/MSm/z相对强度定量相对强度m/z鉴定表达比率＝d(0)强度/d(8)强度d(0)d(8)ICAT用于蛋白质定量分析步骤iTRAQiTRAQ试剂的结构分别还原烷基化，胰蛋白酶酶切一级质量数相同LC－MS/MS分析SCX分离和馏分收集混合标记样品4组蛋白样品（等量）分别用不同的iTRAQ试剂标记(114115116117)iTRAQ定量分析步骤（4重）二级的报告基团反应定量结果胍基化-乙酰化同位素标记方法胍基化反应（K）乙酰化反应（N-termini）胍基化-乙酰化标记方法原理图采用胍基化-乙酰化同位素标记以后，轻链标记肽段和重链标记肽段质量数相差3.01884Da。胍基化反应（Guanidination）概述：胍基化反应是O-甲基异脲氢硫酸与赖氨酸的ε-氨基发生反应，使赖氨酸转变为高精氨酸。具体反应过程：(1)肽段冻干粉（~ug级）中加入50ul硼酸缓冲液（50mM硼砂，200mM硼酸，pH8.0）.(2)加入200ul胍基化试剂（1MO-甲基异脲氢硫酸溶于1MNaOH），振荡混匀。(3)37℃水浴6-8个小时进行胍基化反应。胍基化反应的特点：反应比较完全。目的：封闭赖氨酸的ε-氨基，使后续的乙酰化反应中只有肽段的N端发生乙酰化反应。胍基化反应能提高以K结尾肽段在MALDI源质谱中的信号强度，因为高精氨酸的胍基（PKa=12.48)比赖氨酸的氨基(PKa=10.48)有更强的碱性，更容易结合质子带上正电荷。乙酰化反应（AcetylReaction)概述：乙酸酐与肽段的N端氨基和赖氨酸的ε-氨基均可发生乙酰化反应。由于前面的胍基化封闭了赖氨酸的ε-氨基，所以只有N端氨基参与反应。氘代乙酰基和H代乙酰基相差3.01884Da。反应过程（接上页胍基化）乙酰化试剂，现用现配。H标试剂:1ul常规乙酸酐+9ul四氢呋喃；D标试剂:1ul氘代乙酸酐+9ul四氢呋喃。用1MHCL调节样品体系pH至8.0.每管加入250ul硼酸buffer,测定确认pH为8.0左右。每管加入1ul乙酰化试剂：一般control组加H标试剂。病理组加D标试剂。混匀，暗处放置过夜反应。（一般半个小时可反应完全）。副反应：苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸上的-OH基会发生酯化反应。反应中的脱水峰比较常见，需要保证H标和D标反应条件的一致性。乙酰化反应的后续处理处理步骤：加入10ul1M甘氨酸，除掉多余的乙酸酐。混匀，暗处放置0.5h。将H标样品和对应的D标样品混合。（会出现沉淀，充分混匀使沉淀消失）去酯化：用1MNaOH调节至pH11，使酯化反应产物水解，消除副反应。用TFA调节至pH3.0.SPE小柱脱盐处理、冻干备用。FTICR-LTQ质谱分析。胍基化-乙酰化同位素标记-LTQ-FTICR-MSAQ整体策略SDS-PAGE样本处理及SDS-PAGE稳定同位素标记-质谱分析－定量分析样本A样本B切胶酶切及提取同位素标记LTQ-FTICR质谱分析定量分析-MSAQAB将胍基化-乙酰化同位素标记方法应用于亨廷顿氏舞蹈病脑脊液样本的差异蛋白质组学分析脑脊液（CerebrospinalFluid）的特点：1.蛋白浓度低：大约只有血浆蛋白浓度的千分之四，约200-700ug/ml。盐浓度高：150mM动态范围大：其中白蛋白50%.IgG15%.HD病CSF分析技术路线A，B，C三组样本分别去除白蛋白和IgGA,B,C三组样本取一部分等量混合成内标（IS）SDS-PAGE样本处理及SDS-PAGE切胶酶切及提取同位素标记LTQ-FTICR质谱分析定量分析稳定同位素标记-质谱分析－定量分析当前结果蛋白定量结果：A组定量331个蛋白（323个＋8个ISOFORMs）B组定量330个蛋白（325个＋5个ISOFORMs）C组定量406个蛋白(398个＋8个ISOFORMs）ABC三组共同定量的蛋白183个（180个＋3个ISOFORMs）ABC三组合并有定量信息的蛋白599个(p0.05).*ISOFORM是指在不相邻的slice鉴定到的同一个蛋白，可能是修饰，降解片断或者ISOFORM等。每个Slice定量蛋白数量分布01020304050600102030405060708091011121314SliceQuantifiedProteinCountGroupAGroupBGroupC每组中定量蛋白的Slice分布定量蛋白质组学所面临的一些问题看一个例子来源：ElliottM,Hardie,D,OhlundL,et.al.Comparativestudyoffivemethodsforquantitativeproteomics,cICAT,iTRAQ,ICPL,O18,andAcetylation,suingTandemMassspectrometry.ASMSPoster,2007cICATiTRAQAcetylation1:13:110:1样本：E.coli全蛋白0.51.510010001042另一个例子-ABRF2007PRGResearchStudyAdvancedQuantitativeProteomics针对已有的定量蛋白质组学技术，43个实验室进行了合作研究主要技术：LF：LabelFreeDIGE：DifferentialIn-GelElectrophoresisICPL：IsotopeCodedProteinLabeliTRAQisobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitationICAT：IsotopeCodedAffinityTag18O：StableOxygenIsotopeLabelSRM：SelectedReactionMonitoring采用的样本-PRG2007SampleDesignSampleASampleBSampleC100µgE.colilysate背景12TotalProteinSpikes-10Non-E.coliproteins-2E.coliproteins100µgE.colilysate12TotalProteinSpikes-10Non-E.coliproteins-2E.coliproteins100µgE.colilysate12TotalProteinSpikes-10Non-E.coliproteins-2E.coliproteinsSpikesatDifferentLevelsandRatiosIdenticalProteinsinPRG2007Sample***E.coliProteinsCarbonicanhydraseICatalaseCytochromecGlucoseoxidaseGlycerokinaseHexokinaseHorseradishperoxidaseLactoperoxidaseMyoglobinSerumalbuminTryptophanaseUbiquitin05101520254.600.310.6710.000.312.200.310.310.674.600.670.45Quantity(pmol)SampleASampleBB组与C组相同ProteinsinPRG2007SampleTable1.ProteinsinPRG07studysamplesQuantity(pmol)1Protein2AccessionNumber3M.W.(kDa)ABRatio(B/A)CarbonicanhydraseI6928.92.501.140.45Catalase46557.50.500.340.67Cytochromec387013.02.5011.504.60Glucoseoxidase15280.00.500.330.67Glycerokinase490454.02.500.780.31Hexokinase293850.00.500.160.31Horseradishperoxidase246643.35.0011.002.20Lactoperoxidase264877.52.500.780.31Myoglobin16116.50.505.0010.00Serumalbumin121366.65.003.330.67Tryptophanase4236651.05.001.560.31Ubiquitin40148.75.0023.004.601SampleCcontainedthesamequantitiesofproteinassampleB.2ProteinswerepurchasedfromSigma-Aldrich.3AccessionnumberinPRGdatabase4AddedE.coliproteinsDemographicsoftheParticipants6(14%)2(4.7%)1(2.3%)8(19%)26(60%)AcademiaVendorOther(non-profit)GovernmentBiotech/pharma4(11%)1(2.9%)1(2.9%)7(20%)22(63%)TotalParticipants=43QuantitativeDataRetur