组合生物合成

CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY组合生物合成CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY一、定义组合生物合成（CombinatorialBiosynthesis）：是在微生物次级代谢产物生物合成基因和酶学基础上形成的,通过对微生物代谢产物合成途径中涉及到的一些酶的编码基因进行操作(如替换、阻断、重组等)来改变生物合成途径产生新的代谢旁路,利用天然产物生物合成机制获得大量新的“非天然”天然产物的方法。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY1985年,Hopwood教授在世界首次报道用遗传工程的手段合成“非天然”的天然产物isochromanequinone,为后来的组合生物合成奠定了基础。这一领域成为天然产物代谢工程研究中最活跃的领域,许多微生物次级代谢研究的专家都加入这一领域的工作,因为组合生物合成有潜力制造出很多先导化合物。美国加州高新技术产业公司研制的埃波霉素(epothilone)作为抗肿瘤药物于2007年上市。霉素原来由纤维堆囊黏细菌产生,其产量低,繁殖时间长,产品无法进行产业化生产。该公司利用基因组合技术使纤维堆囊黏细菌的埃波霉素生物合成基因在链霉菌中得到表达,并通过酰基转移酶功能域替换及羟基化酶基因的阻断,获得了主要产生埃波霉素中抗肿瘤活性最好组分的epothiloneD的基因工程菌。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY组合生物合成通过对天然产物代谢途径的遗传控制来生物合成新型的复杂化合物：一方面，特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以此获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物；另一方面，将不同来源的天然产物生物合成基因进行重组，在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物库所产生的新型天然产物构成了类似物库，有利于从中发现和发展更具有应用价值的药物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY聚酮类(Polyketides)和非核糖体聚肽类(Non-RibosomalPolypeptides)在天然产物中占了相当大的比例，如：CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY其生物合成是由PKS或NRPS蛋白催化、按照功能结构域和催化模块的排列顺序来指导化学结构的形成，编码这些酶（或结构域）的基因通常特征性地成簇分布于染色体的某一区域而构成一个基因簇。这预示研究者们可以通过结构域和模块的功能重排构建重组的PKS或NRPS蛋白，从而控制聚酮或聚肽骨架结构的合成逻辑，以生产新型结构的“非天然”天然聚酮或聚肽化合物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY二、聚酮类化合物聚酮类化合物是由简单脂肪酸在聚酮合酶(Polyketidesynthase,PKS)催化下经过类似长链脂肪酸的合成途径生成的。目前所发现的PKS可以归为三类:(1)Ⅰ型PKS也称为模块式PKS,它由若干个多功能多肽组成,每一个多肽上都分别携带有独特的、非重复使用的催化结构域；(2)Ⅱ型PKS也称为迭代式或芳香式PKS,它是一个多酶复合体的迭代体系(至少包含KS和ACP),通过一套可重复使用的结构域在重复的反应步骤中多次用来催化酚聚酮结构的生成；(3)Ⅲ型PKS是可重复使用的同源双亚基蛋白,属于查尔酮(chalcone)合成酶类。与前两类PKS截然不同,不依赖于ACP,也不像前两类PKS是通过ACP活化酰基辅酶A的底物,而是直接作用于酰基辅酶A活化的简单羧酸。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY1、Ⅰ型PKSⅠ型PKS研究最为透彻,主要由酮基合成酶(ketosynthase,KS)、酰基转移酶(acyltransferase,AT)、酰基载体蛋白(acyl-carrierprotein,ACP)、脱氢酶(dehydratase,DH)、烯酰还原酶(enoylreductase,ER)和酮基还原酶(ketoreductase,KR)等功能域（结构域）组成。这些结构域组成模块化结构。KS、AT、ACP是链延伸反应的“最小PKS”，由AT选择一个延伸单元，通常是乙酸或丙酸，连接到链上，由KS催化缩合反应，ACP吸住链并接受从AT来的延伸单元以备下一步缩合反应。如合成红霉素的PKS由3条多肽链(DEBS1、DEBS2和DEBS3)7个模块组成;合成雷帕霉素的PKS由3条多肽链(RAPS1、RAPS2和RAPS3)14个模块组成。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY延伸完成的长链由硫酯酶（thioesterase，TE）功能域催化环化成红霉素的前体6-脱氧红霉内酯B（6-deoxyerythronolideB,6-DEB)CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYAnalogousenzymaticlogicusedbytheATdomaininmodularPKSs.Theacyltransferase(AT)andacylcarrierprotein(ACP)domainsarepresentinallmodules.Theketosynthase(KS)domainispresentinallchainextensionmodules.Thedehydratase(DH),enoylreductase(ER),andketoreductase(KR)domainsareoptionaldomains.CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYacyltransferase(AT),acylcarrierprotein(ACP),ketosynthase(KS),dehydratase(DH),enoylreductase(ER),andketoreductase(KR)CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY2、Ⅱ型PKSPKSⅡ又称迭代或芳香（iterative）类PKS，其主要合成芳香族的化合物，如蒽环类及四环类化合物等。大部分PKSⅡ型基因由编码最小单位PKS的3个阅读框架组成，即KS/AT、ACP和CLF（链长决定因子）。在生物合成芳香族化合物过程中它们被重复使用，因此又称为迭代型PKS（iterativePKS）；此外还有KR、芳香化酶（aromatase）、环化酶（cyclase）等的参与。属于PKSⅡ的聚酮化合物有放线紫红素（actinorhodin，act）、四并菌素（tetracenomycinc，tcm）和富伦菌素（frenolicin，fren）等。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY3、Ⅲ型PKS1999年,Funa等发现了一种类似苯基苯乙烯酮合成酶的PKS(chalconesynthase-likePKS)———RppA,后来被称为Ⅲ型PKS。PKSⅢ的典型为查尔酮合成酶（chalconesyn-thaw，CHS）类，是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，在不需要ACP的情况下直接催化泛酞辅酶A间的缩合，其主要负责单环或双环芳香类聚酮化合物的生物合成，例如flavolin（淡黄霉素）。与其他PKS的最大差别在于直接以游离的丙二酸单酞辅酶A作底物，无论是PKSⅠ型或Ⅱ型均需要通过酞基转移酶将丙二酸单酞辅酶A或其衍生物转移至KS上。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY三、PKS的组合生物合成聚酮化合物中碳链骨架的构成单位与催化其形成的PKS模块之间有着一一对应的关系。因此,聚酮化合物中骨架结构的改进(如更改链长度、环体系等)可以通过组合生物合成方法改变相应的PKS模块来实现。此外,利用异源单元可以增加聚酮体的多样性,这样的改变一般并不影响聚酮体链的环化和PKS的后修饰,可以得到新的终产物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY1、PKS模块或功能域的减少运用组合生物合成方法对PKS中某一个模块进行去除的操作中,当满足最后一个模块和具有环化功能的酶域可以识别非天然的中间产物的前提时,则减短后的PKS仍然具有催化形成新的聚酮化合物或其结构类似物的功能。如在红霉素生物合成途径中,分别将合成红霉素PKS原有的6个模块减少至1个、2个、3个或者5个,然后将具有环化功能的硫酯酶(thioesterase,TE)结构域分别连于其后,结果相应减短后的PKS催化合成了二酮、三酮、四酮和六酮化合物。这说明TE具有广泛的底物特异性,对聚酮体结构也有一定的宽容性,因此通过直接改变它的位置可以间接调整产生聚酮化合物的链长度。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY2.PKS中模块或功能域的增加Rowe等以合成红霉素和雷帕霉素的PKS为研究对象,首次成功地实现了模块添加的设想。方法是将合成雷帕霉素的PKS中模块2和模块5分别插入到减短后的DEBS1-TE的模块1和模块2之间,结果得到了在相应位置多出一个结构单位的四酮化合物(图1);将合成雷帕霉素的PKS中模块2和模块5分别插入到全长的合成红霉素的PKS中模块1和模块2之间,结果得到了在相应位置多出一个结构单位的十六元环的聚酮化合物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYMcDaniel等将合成红霉素PKS模块2的KR结构域替换为来自于合成西罗莫司PKS模块4的DHKR结构域,与原模块的结构域相比相当于增加了一个DH结构域,得到了一个含有C=C双键的化合物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY类似地,Kao等将合成红霉素PKS模块2的KR结构域替换为合成西罗莫司PKS模块1的DH-ER-KR结构域,得到了一个新的八元环化合物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY3、模块或功能域的替换在红霉素DEBS1的N端有一个称为荷载域(loadingdomain,LD)的AT和ACP域。已知不同的LD对底物的选择性不同,利用LD对底物的宽容性,用异源替换原LD可以改变所接受的起始单元,从而获得新的聚酮化合物。Marsden等用阿维菌素的LD替换红霉素的LD,在构建的糖多孢红霉菌(Saccharopilysporaerythraea)突变体中,产生了以阿维菌素生物合成起始单位异丁酸和2-甲基丁酸为起始物的红霉素衍生物,添加不同的前体则可合成C-13位为异丙基、2-丁基等红霉素A、B和D衍生物。由于有许多支链羧酸可以成为阿维菌素的前体,因此利用阿维菌素LD广泛的底物特异性可以获得多种红霉素衍生物。CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYLin等用合成雷帕霉素PKS模块2中AT结构域替换合成红霉素PKS模块1中AT结构域,产生了在C-2位缺少一个甲基侧链的新化合物。1CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY此外,对底物特异性要求较宽松的KR结构域有时可决定聚酮体上甲基或羟基手性中心的立体构型,因此,可以用异源替换原合成红霉素PKS模块中的KR结构域,使得6-dEB中的羟基构型发生转变,进而改变6-dEB的立体结构。如用合成雷帕霉素PKS模块2中的KR2结构域替换合成红霉素PKS模块6中的KR5结构域,合成了3-位羟基差向异构的6-dEB衍生物CHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITYCHINAPHARMACEUTICALU