Western_Blot专题PPT汇报

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析栀子花开2013-04-25WesternBlotWesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlotWesternBlot简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年SouthernDNA硝酸纤维素膜（NC膜）DNA－RNA杂交检测Southern印迹法。RNA的印迹分析Northern印迹法单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析Western印迹法双向电泳后蛋白质分子的印迹分析Eastern印迹法WesternBlotWesternBlot基本原理对蛋白质样品进行分离转移到固相载体生物学活性不变保持吸附蛋白质多肽类型转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）一抗处理蛋白溶液封闭剩余疏水结合点清洗未结合的一抗后仅待研究的蛋白质与一抗特异结合抗原抗体复合物WesternBlot标记的二抗处理过的印迹处理指示一抗的位置抗体复合物待研究的蛋白质的位置该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。不足：标记二抗用于多种不同特异性一抗避免了标记很多一抗的需要二抗可以增强信号所以一般情况下都釆用间接法进行检测。WesternBlotWesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlotWesternBlot流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE分离样品•转膜、封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色WesternBlot转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如PVDF膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。WesternBlot转移膜的选择最常用于WesternBlot的转移膜硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜聚偏二氟乙烯膜（PVDF）尼龙膜DEAE纤维素膜尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。WesternBlot湿转系统WesternBlot半干转移系统WesternBlot丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。转膜后检测（此步可以省略）WesternBlot封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1-2h或4℃过夜）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司）封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST或者PBST。WesternBlot一抗、二抗孵育把PVDF膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液（用封闭液按比例稀释），用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗（按比例稀释），摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时。回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。室温：25℃（冬天应适当延长时间）WesternBlot前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用TBST或者PBST，其中的Tween20有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时多次的洗膜比长时少次更有效,要严格保证反应时间。第3步TBST洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。WesternBlot二抗与底物反应显色•辣根过氧化物酶法（HRP）•碱性磷酸酶法（AP）•化学发光显色法（HRP）化学发光底物：A液：鲁尼诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）避光4℃保存B液：H2O2酶：二抗尾部标记的HRP曝光：A、B液提前拿出恢复至室温效果较好；A液50ul+B液50ul1:1混匀，滴于玻板上，将膜正面与液体孵育，柯达成像仪曝光。（A、B液用量根据膜大小可适当调整）WesternBlot膜解吸方法（膜的重复利用）通过加热和去污剂进行解吸原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离（剥脱液），适用于任何化学发光底物系统。酸解吸原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。WesternBlotWesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlotWesternBlot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。WesternBlot结果分析软件Gel-ProAnalyzer4绿色版（附动画演示教程）常见问题分析WesternBlot凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS-PAGE电泳条带比正常的窄WesternBlot转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到预冷的转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温WesternBlot1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高原因对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应（牛奶）4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高WesternBlot杂交信号很弱1.抗体保存不当2.抗原不充足3.膜的漂洗过度原因对策1.抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数WesternBlot1.一抗不是唯一特异的2.二抗出现非特异结合原因对策1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带WesternBlotFurtherReadings生物秀WesternBlotting专题Millipore的蛋白印迹手册Bio-Rad的westernBlotting操作手册Westernblot问题解答专帖谢谢大家！欢迎指正~