蛋白表达技术

蛋白表达技术蛋白表达技术蛋白表达涵义蛋白表达系统组成原核表达真核表达无细胞表达蛋白表达的涵义蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术,在基因工程技术中占有核心地位。宿主载体辅助成分蛋白表达体系的组成一、原核表达系统大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。1977年，Itakura等成功地在E.coli中表达了一种哺乳动物的肽类激素－生长激素抑制素，从而首次实现了外源基因在原核细胞中的体外表达。这被认为是基因工程发展史上的一座里程碑。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；②商品化的载体和菌株种类非常齐全；③表达效率高；④易培养，成本低。缺点：①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；②蛋白质不能糖基化；③其内毒素很难除去。StrainvectorgrowthconditionsFactorsinE.coliproteinexpression一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。表达载体表达系统中最重要的元件是表达载体，表达载体应当具有表达量高、稳定性好、适用范围广等优点。表达载体主要包括启动子、表达阅读框、终止子、复制起点以及抗性筛选标记等重要元件近年来的研究表明，在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有pGE系列、pQE系和pET系列，其中目前被广泛应用的高效表达载体是pET。复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子通常表达载体都会选用高拷贝的复制子选择性基因-筛选标记：蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子通常表达载体都会选用高拷贝的复制子选择性基因-筛选标记：蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列转录形式：组成型、诱导型强弱：取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。—表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。T7启动子----最常用启动子基于T7RNA聚合酶及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的pET系统(No-vagen)是最常用的E.coli表达系统。T7NAP机制在诱导蛋白表达时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，而且表达产物产量也特别高。终止子：终止点前含有一段7-20bp的回文序列，可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。融合标签：利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。标签位置的选择：----N端融合：易于构建。终止密码子来自载体基因，表达量高提前终止会干扰纯化二级翻译起始，不影响纯化----C端融合：构建时注意避免移码，基因不能自带终止密码子，提前终止不影响纯化，二级翻译起始会干扰纯化常用融合标签•His·TagpET系统•GST·TagpGEX系统MBP·TagpMal系统TrxHISHis6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。优点：•标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；•His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下（纯化疏水性强的蛋白）或变性条件（纯化包涵体蛋白）下纯化，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；•His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；•His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。•可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；•可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。Flag标签蛋白Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。优点：•FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。•融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。•FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过WesternBlot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。•融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。MBP（麦芽糖结合蛋白）MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。优点：•MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。•MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签•如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。•纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。GST(谷胱甘肽巯基转移酶)GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。优点：•作为高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。•可在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。•标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。•GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。•如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。•检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用表达载体系统目的蛋白表达形式及在细胞中的定位蛋白表达形式分泌蛋白:采用信号肽序列可以将蛋白直接分泌到细菌的周质腔去。可溶性蛋白:目的蛋白与一段融合标签序列（FLAG、His－Tag、GFP等)融合表达而形成包涵体蛋白:包涵体蛋白的形成是由于肽链折叠过程中，部分折叠中间态发生特异性错误聚合，不能形成成熟的天然或完全解链的蛋白所致宿主菌的选择用于克隆的宿主菌K12系列NovaBlue，JM109以及DH5a。特点：recA–endA–型，转化效率很高，且质粒产量高，适合用于保存带有克隆目的基因的pET载体。用于表达的宿主菌所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner特点：都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表达菌E.coli宿主菌名称特征用途抗性DH5α带有recAendA突变的克隆菌株，由于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。无BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU和proL基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY和leuWtRNA基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-plysS带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS菌株在被诱导前T7RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白更严格的本底表达控制，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达补充7种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性卡那霉素、氯霉素、四环素Rosetta-Blue带有recAendAlacIq突变的克隆菌株,高蛋白表达,补充大肠杆菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六种稀有密码子对应的tRNA。补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平氯霉素表达条件优化增加可溶性和折叠选择大肠杆菌偏爱密码子毒性基因及质粒稳定性合适载体与宿主菌组合表达条件优化菌株适合启动子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)Transetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）例1:载体对表达的影响pET32,BL21(D