绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白——将色彩引入生命科学研究GFP——BringtheColorstotheStudyforLifeScience南京师范大学生命科学学院张朝2011.11.9绿色荧光蛋白的分子生物学及其应用TheNobelPrizeinChemistry2008forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFPOsamuShimomuraMartinChalfieRogerY.TsienMarineBiologicalLaboratory,WoodsHole,MA,USA;BostonUniversityMedicalSchoolMassachusetts,MA,USAColumbiaUniversityNewYork,NY,USAUniversityofCaliforniaSanDiego,CA,USA;HowardHughesMedicalInstitute2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面公认的先驱。马丁·沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(AequoreaVictoria)中分离出了GFP(Green-FluorescentProtein)。绿色荧光蛋白的研究史维多利亚水母(AequoreaVictoria)Atesttubecontainingasampleofacyan(greenish-blue)fluorescentproteinfromaseaanemoneilluminatedbyultra-violetlightfrombelow.水母体内有一种发光蛋白——Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色萤光。这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质，就是GFP•水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP发出绿光1.水母发光蛋白脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光•绿色荧光蛋白绿光•水母素在钙离子的刺激下发光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。钙离子蓝光发光过程下村修下村修因此成为首位从水母中分离出GFP，并发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色的科学家，他被誉为生物发光研究的第一人1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。绿色荧光蛋白的研究史马丁·沙尔菲如果说下村修是绿色荧光蛋白的“接生婆”，沙尔菲则是绿色荧光蛋白的价值发现者。马丁·沙尔菲等对实现GFP的基因表达做出了突出的贡献他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用。绿色荧光蛋白的研究史1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。钱永健钱永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。钱永健的主要贡献在于利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应，他是这方面公认的先驱。之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。1997年10月18-22日在美国New-Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。绿色荧光蛋白的研究史2007年1月7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。这是继美国、韩国、日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析维多利亚水母GFP的cDNA编码区全长717nt绿色荧光蛋白的结构解析维多利亚水母GFP由238aa组成，分子量约27kD绿色荧光蛋白的结构解析GFP晶体结构显示,蛋白质中央是一个罐形结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,罐的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。绿色荧光蛋白的结构解析AtopologydiagramofthefoldingpatterninGFP.The-sheetstrandsareshowninlightgreen,a-helicesinblue,andconnectingloopsinyellow.Thepositionsinthesequencethatbeginandendeachmajorsecondarystructureelementarealsogiven.Theanti-parallelstrands(exceptfortheinteractionsbetweenstrands1and6)makeatightlyformedbarrel.ThegreenfluorescentproteinGFPconsistsof238aminoacids,linkedtogetherinalongchain.Thischainfoldsupintotheshapeofabeercan.Insidethebeercanstructuretheaminoacids65,66and67formthechemicalgroupthatabsorbsUVandbluelight,andfluorescesgreen.绿色荧光蛋白的罐形结构绿色荧光蛋白的结构解析Thedimercontactregion.Thetwopolypeptidechainsassociateoverabroadarea,withasmallhydrophobicpatch(intheyellowbox)andnumeroushydrophiliccontacts.Thetwo-foldsymmetryaxisisintheplaneofthepage,andismarkedbytheredarrow.Thepolarresiduesaremarkedwithredatomsforoxygenandbluefornitrogen.绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。绿色荧光蛋白的发光特性GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合也适用GFP观察。尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。但GFP对某些封片指甲油特别敏感。GFP荧光在pH7.0-12.0稳定，在pH5.5-7.0开始受到影响，高温(70℃)、极端pH或胍基氯化物条件下，GFP会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。绿色荧光蛋白的发光特性GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。绿色荧光蛋白的发光基团GFP荧光的产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。GFP荧光生色团翻译出的蛋白质折叠环化之后,在O2存在下，分子内Gly67的酰胺对第Ser65的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,Tyr66的α2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样,GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程可以自动催化完成。绿色荧光蛋白的发光基团Stereoviewofthefluorophoreanditsenvironment.His148,Gln94andArg96canbeseenonoppositeendsofthefluorophoreandprobablystabilizeresonantformsofthefluorophore.Charged,polar,andnon-polarsidechainsallcontactthefluorophoreinsomeway.绿色荧光蛋白的发光基团His48Gln94Arg96ModelofthefluorophoreanditsenvironmentsuperposedontheMAD-phasedelectrondensitymapat2.2Åresolution.Thecleardefinitionthroughoutthemapallowedthechaintobetracedandsidechainstobewellplaced.ThedensityforSer65,Tyr66andGly67isquiteconsistentwiththedehydrotyrosine-imidazolidonestructureproposedforthefluorophore.Manyofthesidechainsadjacenttothefluorophorearelabeled.绿色荧光蛋白的发光基团目前对GFP的荧光发光机制还不清楚，Morise等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。Chattoaj等对GFP进行了光谱分析，结合前人工作提出，GFP有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态B对应于475nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1/6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态(*)之间的转换很快且发生了质子转移，A*快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A*转变成I*,I*回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I*转变成B*，由B*到B发射荧光而不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。绿色荧光蛋白的发光机制475nm504nm绿色荧光蛋白的发光机制在离体状态下GFP对高温(70OC)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶除外)有较强抗性GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些