real-timePCR与引物设计

PCR引物设计、RNA提取与RealTimePCR冀伟PCR引物设计原则如何设计PCR引物RNA提取Real-timePCRPCR引物设计的重要性用得较多的引物设计软件有：Oligo6.0()Primerpremier4.11(．Premierbiosoft.comdemoversion)引物在PCR反应中处于关键作用。而在目前DNA的化学合成技术非常成熟的情形下，引物设计是否合适是我们应更为关注的层面。引物决定着扩增的特异性和扩增的效率。引物设计影响到后续载体构建的效率引物设计影响到实验的成本PCR引物的寡核苷酸数（长度）一般在16～30个核苷酸（NT）至少为16个核苷酸最好为20～24个核苷酸以上指与模板链完全配对的碱基数问题：1)太短，特异性差；2)太长，自身折叠形成二级结构；Tm过高，不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始二级结构。引物的碱基组成GC为40～60％ATGC最好随机分布问题：1)GC％太低扩增效果不佳2)GC过多易出现非特异条带3)避免成串的嘌呤和嘧啶引物的Tm值主要考虑的因素有：I反应体系对引物退火温度的影响。如酶的最适工作温度对引物退火温度的限制等。太低，引物与模板非特异结合，出现非特异扩增条带。太高，引物与模板结合不牢固，无扩增。扩增特异基因，Tm一般选40～60℃如何用软件设计PCR引物1.在NCBI核酸序列数据库中获得待设计引物的基因序列（gDNA）及表达序列（CDS序列）2.根据gDNA及CDS序列，明确CDS序列中内含子的确切位置（如果表达载体构建，则只需要明确编码序列中起始密码子（ATG）与终止密码子(TAA/TAG/TGA)的位置即可）3.根据Realtime-PCR引物设计原则，用Oligo6.0软件设计跨内含子引物（1）序列导入（2）根据需要修改待设计引物长度（3）根据引物设计原则，肉眼选择合适引物（4）评估引物Oligo6.0引物软件的操作使用1.序列输入File菜单→Newsequence→粘贴序列（CDS序列、mRNA序列、DNA序列）Oligo6.0引物软件的操作使用2.根据需要修改待设计引物长度Change菜单→CurrentOligolegth→修改引物长度（17-25nt）Oligo6.0引物软件的操作使用△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。3.根据引物设计原则，肉眼选择合适引物1.△G值：5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。2.Tm：40～60℃，上下游引物之间的Tm差距越小越好。3.Frq：错误互补配对的频率；1000,越小越好。注：该软件给出的Tm比实际值高出10℃4.评估引物Tm、GC%、上下游引物Tm的差距、PCR产物扩增长度引物形成二聚体的情况引物发卡结构形成的情况正确互补配对引发效率和错误互补配对引发效率Tm、GC%、上下游引物Tm的差距、PCR产物扩增长度4.评估引物上游引物自身形成二聚体的情况下游引物自身形成二聚体的情况上下游引物自之间形成二聚体的情况引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。上游引物发卡结构形成的情况下游引物发卡结构形成的情况DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。=BlastHome5.引物特异性比对-输入引物序列5.引物特异性比对-选择物种对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。5.引物特异性比对-分析比对结果RNA提取成败之关键1.RNA提取试剂盒选择原则：根据样品种类（细胞或组织）、取材难度而定QIAGEN、Invitrogen、Omega、Takara、北京天根、全式金2.研磨方法选择原则：根据样品种类（细胞或组织）3.病例或病理组织样品保存原则：A.取材容易，现取现用B.取材不易，先液氮，后超低温（-80℃）保存4.RNA提取准备工作1）RNA提取环境：超净工作台2）试剂准备：0.1%DEPC水（已121℃高温高压灭菌至少50min）配制的3%过氧化氢或0.5Mol/L氢氧化钠及75%酒精（用没有开封过的无水乙醇配制）、已灭菌0.1%DEPC水配制的核酸电泳TBE缓冲液，其他试剂（均为未开封，或RNA提取专用）3）器材准备：移液枪、PE手套或橡胶手套、废液瓶、无RNA酶的EP管、PCR管、枪头；量筒等玻璃器皿（150-180℃高温干热灭菌5-8小时）。4）杜绝RNA污染及降解的准备工作：依次用0.1%DEPC水配制的3%过氧化氢或0.5Mol/L氢氧化钠及75%酒精擦拭台面、移液枪、未开封PE手套及均未做过无RNA酶处理物品（如离心管架）的外表面。5）操作手法a.混匀操作：如果液体体积在100ul以内，用指头弹击管底混匀；在100-400ul之间，用振荡器混匀；大于400ul，用手晃动混匀：晃动时使离心管底永远处于斜上位置，频率要快。b.上清移取：离心管倾斜，根据上清的量选择不超过200ul的移液器，在离心管外先压下移液枪，再将枪头移入上清。枪头尖尽可能靠近液面，枪头尖嘴接触内壁，缓慢松手移取上清，可多次移取，并且留下1mm以上的液体不要吸取。不可用1mL移液枪吸取上清。c.整个RNA提取及反转录过程勤换PE手套（每研磨或裂解一个样品换一次手套，每隔一个步骤也需换一次手套）谢谢！欢迎各位老师、同学提问