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生化技术综合实验报告设计（论文）题目植物超氧化物歧化酶(SOD)的提取2012年6月摘要超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase简称SOD）是一种新型酶制剂，别名肝蛋白、奥谷蛋白。是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。本次实验主要是从黄瓜中粗提SOD，采用热变性沉淀法、等电点沉淀法、45%，90%，100%硫酸铵分级沉淀法、DEAE-纤维素离子交换色谱来去除杂蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所提蛋白的组分，以及鉴定是否含有SOD。结果说明，我们小组提到的粗酶液中含有SOD和很多杂蛋白。关键词：植物超氧化物歧化酶（SOD）；SOD提取方法；SDS-PAGE一、实验目的意义：本实验是从黄瓜中粗提SOD,因为SOD是人体内的垃圾清道夫，它被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。并且通过多种方法运用到实际中[1]。在实验操作的过程当中，进一步熟悉并掌握热变性沉淀法的基本原理和操作、硫酸铵分级沉淀法的基本原理和操作、等电点沉淀法的基本原理和操作；掌握细胞破碎技术及选择破碎方法的依据；回顾离心机的使用方法，并会正确操作；掌握透析技术以及检测透析效果的方法和步骤；掌握离子交换色谱技术，并学会操作DEAE-纤维素离子交换色谱；了解AKTApurifier蛋白纯化，分离系统的原理和操作方法；掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的原理与操作步骤；标准蛋白Marker测定样品的组分原理及鉴定。二．实验原理:1.1热变性沉淀法的基本原理：热变性沉淀法主要是利用生物大分子对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，而保留另一些组分。SOD是一种热稳定性很好的酶，当温度低于80℃时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化。而一般的杂蛋白在高于55℃就易变性沉淀[3]，则我们可以采用热变性沉淀法来去除杂蛋白。[2]1.2等电点沉淀法的基本原理：等电点沉淀法主要是利用生化物质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性生化物质具有不同的等电点这一特性，对蛋白质，氨基酸等两性生化物质进行分离，纯化的方法。不同pH对分离SOD的影响在pH值在1.0到7.0之间，调节SOD粗酶液的PH，不同PH对SOD分离的影响。实验结果表明：在pH＝5.0时，总蛋白含量最低，SOD总活力最高[3]。所以我们可以调节粗酶液的pH＝5.0时，利用等电点沉淀法来去除一部分杂蛋白。[2]1.3硫酸铵分级沉淀法的基本原理和操作：在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。蛋白质、多肽、多糖和核酸等生物大分子都可以用盐析法进行分离。则可以采用不同浓度的硫酸铵饱和溶液来析蛋白。实验结果表明：在硫酸铵饱和度为45%和90%时，SOD比活最高，说明分离效果最明显[2]。所以我们可以利用硫酸铵分级沉淀法来分离SOD。[2]1.4离子交换色谱的基本原理：离子交换色谱技术是离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与离子交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种色谱方法。在本实验中，我们采用离子强度更大的Nacl溶液来对粗酶液进行离子强度梯度洗脱，实现离子交换，达到进一步纯化的作用。[2]1.5SDS-PAGE鉴定提取液的组分的基本原理：SDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有SDS和疏基乙醇的样品处理液，SDS（十二烷基磺酸钠）是一种表面活性剂，可破坏蛋白质的二级三级结构，最后的电泳速度只决定于被分离的生物分子量。它显示的条带从上到下依次按相对分子质量由大到小排列的。在点样时加入标准蛋白Marker，就可以大概地测定所提样品中所含有的组分，以及根据SOD的相对分子质量，来确定样品中是否含有SOD.三、实验材料和方法及现象：1.1实验材料、试剂及仪器设备：实验材料：新鲜黄瓜（从学校教职工农副食品配送中心买得）；试剂：pH7.80.05mol/L的磷酸盐缓冲液；0.1mol/L盐酸，固体硫酸铵粉末，1mol/LNaCl溶液；丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺；1M、2MTris-Hcl；十二烷基磺酸钠（SDS），10%的过硫酸铵溶液；四甲基乙二胺（TEMED）,Tris甘氨酸，甲醇，冰乙酸；考马斯亮蓝G-250，标准蛋白Marker，BaCl2，蒸馏水。仪器设备：高速离心机AKTApurifier蛋白纯化分离系统；DEAE-纤维素离子交换色谱柱(DEAE-SFF)；电泳仪和电泳槽（BioradMiniⅡ）；透析袋(XH419);果汁机，漏斗，纱布，容量瓶，电子天平，冰箱，水浴锅；玻璃棒，量筒，移液管，烧杯，，酸度计，研钵；磁力搅拌器，，摇床，玻璃器皿。1.2实验步骤：1.2.1试剂的配制：1.2.1.1PH7.80.05mol/L的磷酸盐缓冲液配制方法[4]：A液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：用电子天平准确称取35.82gNa2HPO4.12H2O溶解于蒸馏水中，再用容量瓶定容至500ml；B液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：用电子天平准确称取15.605gNaH2PO4.2H2O溶解于蒸馏水中，再用容量瓶定容至500ml；pH7.80.05mol/L磷酸盐缓冲液：用量筒和移液管分别准确量取91.5mlA液，8.5毫升B液，将它们充分混合后，再用蒸馏水稀释成400ml。1.2.1.2配制500毫升1mol/LNaCl溶液：用电子天平准确称取5.850gNaCl固体粉末溶解于蒸馏水中，再用容量瓶定容至500毫升。1.2.1.3配制250ml0.1mol/L的盐酸溶液：用量筒量取2.129ml36%的浓盐酸，加水至250ml即可。1.2.2处理材料：用清水将黄瓜洗干净后，用天平准确称取300克，用量筒准确量取200ml磷酸盐缓冲液，以1.5:1[3]比例加入黄瓜中，先加100ml缓冲液和少许石英砂后立即放到果汁机中，将黄瓜充分搅碎，用漏斗和纱布过滤得到滤液。1.2.2.1现象：滤液颜色鲜绿，浓度很高。1.2.3提取粗酶液：将滤液装在离心管里平衡后放入高速离心机，在4℃5000r／min下离心20min，使悬浮物完全沉淀，把剩余的100ml缓冲液加入到沉淀中，充分混匀后放入4℃冰箱冷藏30min，之后取出来再在4℃5000r／min下离心20min，弃去沉淀，合并2次的上清液即为粗酶液。1．2.3.1现象：粗酶液的颜色稍微变淡一小点，浓度也变稀啦一点。1.2.4热变性沉淀法去除杂蛋白：先将恒温水浴锅的温度调到55℃，待稳定后再把粗酶液放入进行热变性，使杂蛋白变性沉淀，25min后取出拿去4℃5000r／min下离心20min.去除沉淀，保留上清液。1.2.4.1现象：上清液的颜色较粗酶液又变浅一点，浓度也变稀了。1.2.5等电点法去除杂蛋白：用酸度计调节上清液，使其PH达到5.0，在调节的过程中，要逐滴地加，并充分搅拌，以免加了过量。调好后拿去4℃5000r／min下离心10min，收集上清液（370ml）。1.2.5.1现象：上清液的颜色特别淡，接近无色。1.2.6硫酸铵分级沉淀法：在上清液中加入102.49克硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，加完后再用磁力搅拌器搅拌30min让溶液充分混匀，使其饱和度达到45%，冷藏静置90min，拿去4℃5000r／min下离心15min，去除沉淀，取上清液，再加入125.43克硫酸铵粉末后，再用磁力搅拌器搅拌15min，使其饱和度达到90%，冷藏过夜后拿去4℃5000r／min下离心40min，取出沉淀即粗蛋白并称量有4.0714g，把沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，待上柱。再在上清液（350ml）中加入30克硫酸铵粉末，用磁力搅拌器搅拌30min后，冷藏静置2个半小时，拿去4℃5000r／min下离心10min，取出沉淀即粗蛋白并称量有3.1964g，溶解于磷酸盐缓冲液中，待上柱。注：室温25℃下，硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度时，1升溶液中应加入的硫酸铵粉末的质量：[2]硫酸铵初浓度（%）04590硫酸铵终浓度（%）4590100硫酸铵粉末的质量（g）27739979则我们组：饱和度达到45%时应加入的量：0.277×370=102.49g饱和度达到90%时应加入的量：0.399×370=125.43g饱和度达到100%时应加入的量：0.079×350=27.65g1.2.6.1现象：冷藏过夜后，溶液变得混浊。1.2.7DEAE-纤维素离子交换色谱：1.2.7.1脱盐（去掉小分子物质）：先将带上柱的所有溶液、样品进行0.45µm的滤膜微滤。打开电脑主机和电源进行预热。然后用pH7.80.05mol/L的磷酸盐缓冲液清洗管道和柱子，把杂质和气泡排出，把泵的流速调到1.5ml／min，机械平衡后就可以用样品环上样啦，将样品吸入注射器，排出气泡，从进样阀的3号位推入（进样量不得低于样品环的体积的3倍），不要取下注射器。选择manual→flowpath→injectionValve→inject，execute洗脱速度控制在3ml／min。1.2.7.2用1mol/L的Nacl溶液对收集到的硫酸铵饱和度90%的SOD提取液进行浓度梯度洗脱：将样品进行脱盐后，就可以用1mol/L的Nacl溶液对收集到的SOD提取液进行离子强度梯度洗脱，实质是进行阴离子交换。速度控制在3ml／min。1.2.7.3洗脱完后，一定要记得清洗柱子，泵等。1.2.8采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定SOD以及样品中所含的组分：1.2.8.1凝胶的配制：分离胶(占胶板的80%左右)的配制：A液B液（用时微加热）蒸馏水10%过硫酸铵溶液TEMED4ml2.5ml3.5ml50ul5ul堆积胶（占胶板的20%左右）的配制：A液C液蒸馏水10%过硫酸铵溶液TEMED0.67ml1.0ml2.3ml30ul5ul1.2.8.2凝胶的安放：将电泳装置放入电泳槽后，短板朝外，先加分离胶，在分离胶上加一层蒸馏水，让分离胶最上层变平，待分离胶凝固好以后，用滤纸把水吸干，接着加堆积胶。1.2.8.3加上样液：有2块凝胶，一块是现配的，另一块是一个月前配的，加上样液时，短板朝内，先加5ul上样缓冲液，再加20ul上样液（上样液：上样缓冲液都是4：1），水浴加热10min后，拿掉梳子，一定不能有气泡，要把蒸馏水吸干。1.2.8.4点样：第一块凝胶从左向右点样，第二块凝胶从右向左点样，都是第1个孔加标准蛋白Marker（分子量有3KD、5KD、10KD、15KD、20KD）5ul，第2个孔加标准细胞色素c5ul，第3个孔加硫酸铵饱和度90%的SOD提取液20ul,第4个孔加硫酸铵饱和度100%的SOD提取液20ul,第5个孔加提取的细胞色素c20ul。1.2.8.5加电泳缓冲液并进行电泳：在电泳槽中加入1MSDS缓冲液至与玻璃板相平，把电压调至150V(恒定电压)，电泳1h。现象是有气泡丛底部均匀地向上冒，说明小分子已经在跑啦。1.2.8.6染色：取出胶板放入玻璃器皿中，加入SDS-PAGE考马斯亮蓝染色液R-250，将玻璃皿放在摇床上1h，使染色液与胶板充分混匀。1.2.8.7脱色：染色1h后，加入脱色液，在摇床上脱色1h，重复脱色3次后，现配的凝胶板上标准蛋白Marker，标准细胞色素c，硫酸铵饱和度90%的SOD提取液都显示出了条带。其他几个均无明显现象。但一个月以前配的那块无现象，说明已经不能用了，再进行最后一次脱色，加入脱色液后，静置过夜。1.2.9透析：把剩下的样品拿去透析，先用蒸馏水浸泡透析膜10min，把一边用棉线扎起来，然后就可以装入样品提取液，装好之后，把另一边也要用棉线扎紧，之后放入装有蒸馏水的大烧杯中，并用磁力搅拌器搅拌，每隔1h换一次水，换3次过后，就透析静置过夜。第二天早上向透析液中加入少许BaCl2粉末，溶液没有变浑浊，再接着加少许硫酸铵粉末，溶液马上变浑浊，说明透析效果好。本来可以把样品进行浓缩、干燥之后就可以制得成品，但是我