过氧化氢空间灭菌技术的发展趋势

1过氧化氢空间灭菌技术的发展趋势刘万忠(湖北荷普药业股份有限公司)一、过氧化氢溶液消毒应用现状过氧化氢(H2O2)是一种天然存在的化学物质，广泛存在于空气和水中。早在十八世纪，人类就发现并开始使用双氧水，并广泛运用在食品、饮料、医疗器械和卫生保健领域。过氧化氢的使用主要是依赖其氧化性，不同浓度的过氧化氢具有不同的用途。一般医用过氧化氢（俗称双氧水）的使用浓度为3%，主要用于伤口或中耳炎消毒[1]。当它与皮肤、口腔和黏膜的伤口、脓液或污物相遇时，立即分解生成氧，这种尚未结合成氧分子的氧原子，具有很强的氧化能力，与细菌接触时，能破坏细菌菌体，杀死细菌。杀灭细菌后剩余的物质是无任何毒害、无任何刺激作用的水和氧气。不会形成二次污染和产生耐药性。因此，医用双氧水是伤口消毒的理想消毒剂。工业用过氧化氢的浓度一般为25-50%，高浓度过氧化氢具有强烈腐蚀性并有发生爆炸的危险，浓度大于8%就需要用特殊容器进行包装运输。液态过氧化氢用于消毒时需要较高浓度和较长接触时间才能杀死高抗性微生物，比如细菌芽孢和霉菌，如美国FDA批准Reckitt&ColmanInc.生产的7.5%过氧化氢消毒液用于表面高水平灭菌时，要求20°C浸泡灭菌时间为6hrs。二、过氧化氢复合消毒液的研究为了充分发挥过氧化氢消毒灭菌的优势（无耐药性和无残留），克服其缺点（高浓度腐蚀性及低浓度低效性），国内外研究人员对其复合消毒液进行了研究。如徐燕等人[2]报道了过氧化氢复合消毒液（含山梨酸、苯甲酸等抑菌剂）的杀菌效果以及对空气的消毒效果,以含过氧化氢10.91g/L、7.272g/L该复合消毒剂分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用45min,杀灭率均达100%；以含过氧化氢36.36g/L的该消毒剂作用30min,对白色念珠菌的杀灭率达99.9%以上。以含过氧化氢9.03g/L该复合消毒液,按10ml/m3用量进行气溶胶喷雾消毒,作用15min对气雾柜内人工喷染的白色葡萄球菌的杀灭率达100%；作用30min对室内空气中自然菌消亡率达90%以上。梁金平等人[3]研究复合过氧化氢乙醇手消毒液的消毒相关性能。结果该复方消毒液原2液含过氧化氢15.5g/L和含体积分数20%乙醇。以含过氧化氢10.85g/L的该复方消毒液对悬液内的金黄色葡萄球菌作用1min,对铜绿假单胞菌作用0.5min,平均杀灭对数值均≥5.00。以含过氧化氢12.40g/L的该复方消毒液作用1min,对白色念珠菌的杀灭对数值≥4.00。用含12.40g/L过氧化氢的该复方手消毒液作擦拭消毒作用1min,对手上自然菌的杀灭对数值1.00。薄玉霞等人[4]报道了一种过氧化氢银离子复方消毒剂消毒相关性能。结果以含100g/L过氧化氢与109mg/L的银离子复方消毒剂,对载体上枯草杆菌黑色变种芽孢作用90min,或对污染在止血钳齿端上的枯草杆菌黑色变种芽孢作用90min,均可达到完全杀灭。杨美玲等人[5]报道了一种过氧化氢与过氧乙酸复合消毒液的消毒效果,采用悬液定量杀菌试验和空气消毒试验进行室观察,结果,以含过氧乙酸164.8mg/L与过氧化氢474.0mg/L的复合消毒液,作用15min,对悬液内大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值分别为7.55和7.44。以含过氧乙酸1648mg/L与过氧化氢4740mg/L复合消毒液,作用15min,对染于载体上的枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭对数值为7.49。以含过氧乙酸4120mg/L与过氧化氢11850mg/L该复合消毒液,按10ml/m3用量进行室内空间气溶胶喷雾,密闭作用15min,对空气中人工污染的白色葡萄球菌消除率为100%;以同样用量对现场室内进行气溶胶喷雾,密闭作用30min,对空气中自然菌的平均消亡率为95.89%。美国FDA批准的复合过氧化氢消毒液对医疗器械消毒和灭菌方法方法[6]为①用73.5g/L过氧化氢+2.3g/L过氧乙酸在20℃条件下作用15min可达到高水平消毒,作用180min可达到灭菌,最长可使用2周；②用10g/L过氧化氢+0.8g/L过氧乙酸在20℃条件下作用25min可达到高水平消毒，作用8h可达到灭菌,最长可使用2周。由此可见,过氧化氢与某些消毒剂如乙醇、有机酸、银离子和过氧乙酸等物质合用具有协同作用,由此组成的复合消毒剂均能降低过氧化氢的使用剂量,随之也缩短了过氧化氢的消毒时间。但这些复合消毒剂仍然具有较强的腐蚀性，特别是过氧化氢与过氧乙酸复合时腐蚀性更大,因为过氧乙酸的腐蚀性远远大于过氧化氢。三、过氧化氢空间灭菌技术的现状上个世纪80年代，美国的研究人员首先发现气态过氧化氢的杀灭细菌能力大于液态过氧化氢的200倍以上。即过氧化氢在气相态下仅需较低的浓度即可达到高浓度液态过氧化氢具备的杀孢子能力，由此出现了两种不同利用过氧化氢气体的消毒灭菌技术[7]：即气化过氧化氢灭菌技术和过氧化氢“干雾”消毒灭菌技术。3（一）气化过氧化氢灭菌技术气化过氧化氢灭菌技术大多是利用闪蒸技术，将高浓度的过氧化氢溶液（浓度一般大于30%）滴加至加热的光滑金属物体表面使其瞬间气化为化2-6微米的颗粒。目前主要分为两大阵营，分别为美国Steris（斯泰瑞）的干法VHP（VaporizedHydrogenPeroxide）灭菌技术和英国Bioquell（倍尔科）的湿法HPV（HydrogenPeroxideVapour）灭菌技术。目前汽化过氧化氢灭菌法已成为各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范所推荐的方法，灭菌工艺已经非常成熟，重复性好，有专门的化学指示剂和生物指示剂验证过氧化氢气体分布均匀情况和无菌保证水平。可广泛应用于在生物制药工厂、医疗卫生、生物实验室和动物研究实验室等诸多领域[8]。SterisVHP技术[8]：是通过气化低浓度过氧化氢产生氧游离基作用于表面与环境中的微生物，针对于破坏DNA的特性具有广谱杀菌效果。美国Steris公司是过氧化氢灭菌技术的创始者。Steris通过实验证明汽化过氧化氢750-2，000ppm浓度的灭菌效果等同于300，000ppm过氧化氢液态浓度的灭菌效果，因此气态过氧化氢具有更好的杀菌效果。SterisVHP技术一般经过以下过程：（1）除湿处理（Dehumidification）降低腔体内相对湿度在10-30%，，向腔体内注入已加热的低露点压缩空气以进一步降低相对湿度。（2）进汽稳定阶段：干燥空气携带汽化的过氧化氢通过高效过滤器以一定的速率注入腔体内，过氧化氢经过一定时间的扩散，浓度逐渐稳定在预期值时进入消毒灭菌阶段。(3)灭菌消毒阶段：以某一恒定的进汽速率维持室内过氧化氢浓度，达到规定灭菌消毒时间后停止注入汽化过氧化氢，通过计算D值并保证净化腔中6log的杀灭率。(4)汽化过氧化氢的清除阶段：灭菌结束后，经高效过滤器向腔体内充入无菌干燥、空气，当腔体内压力和大气压一致时，停止进气，真空泵将腔体内混合空气抽出，新风与排风均经HEPA过滤，防止任何再污染（包括停电期间），残留的过氧化氢气体在催化器作用下被转化成对环境无害的氧气和水，只有当腔体内VHP浓度低于1ppm时，才能打开无菌端的门，一个灭菌过程结束。主要代表产品型号有移动式汽化过氧化氢（VHP）灭菌设备--VHP1000ED。4BioquellHPV技术[9]：即微冷凝工艺。微冷凝工艺被描述成术语微冷凝可被定义为HPV冷凝微膜，这是一种亚微米级的膜，裸眼看不到。科学研究已经证明，实际上正是气体消毒过程中的这个低温、无残留的凝结过程使微生物失去了活性。当过程达到凝露点时，达到log级灭菌效果（D‐值）所需的时间最短。BioquellHPV技术一般经过以下过程：（1）实现环境条件（Conditioning）取得40%左右的相对湿度和温度；（2）进汽（Gassing）不断提升过氧化氢浓度；（3）进气维持（GassingDwell）保持浓度，维持一定时间用以灭菌；（4）通风（Aeration）从腔体内移除过氧化氢。主要代表产品型号有CLARUSL2过氧化氢蒸汽发生器和BIOQUELLZ房间灭菌系统。这2种类型的设备虽然在国外已在在传递舱、隔离器、冻干机、生物安全柜、医疗器械、生物培养箱和气闸间等获得了广泛的应用，但因要使用高浓度的过氧化氢溶液（浓度大于30%），无论何种措施都很难完全保证避免腐蚀，特别是对彩钢板墙壁和环氧地面会产生强烈腐蚀，也无法避免对环境和人员造成的危害，这是回避不了且隐患巨大的风险！因此很少有企业用于GMP车间洁净区域的消毒，同时由于结构复杂，售价高达80万元以上，国内企业也使用较少。国内的代表产品如东富龙公司将自主研发的过氧化氢蒸气灭菌系统（HPVSV-50）应用于冻干机进行灭菌，售价高达80万以上也在40万元以上。创新性的DVHP®技术：DVHP®是上海净达制药设备系统工程有限公司研究的一种改良的干法工艺，集合了干法过氧化氢灭菌的优点，也具备了微冷凝法所拥有的便利：①使用的过氧化氢气体浓度更低，且可以矩阵式监控；②全程高速除湿，保证周期内不会出现冷凝；③对于环境的要求不高。而在常压环境中使用的循环式过氧化氢灭菌技术对密闭的箱体进行消毒、灭菌时，往往会因为死角太多，从而造成消毒，灭菌的失败。正因为过氧化氢气体没有足够的穿透能力，在缺乏有足够动力的载气帮助时，很难渗透到环境中的每一个角落，而DVHP®很好的解决了这个问题，通过真空管路将过氧化氢气体输入真空箱体内部，让气体均匀分布到每个角落，每一段管路。除此以外，由于在真空状态下，过氧化氢的沸点更低，只5需要较低的温度就可以使得液体转化为气态，能够比非真空状态下更好地维持气体状态。代表产品型号有DVHP®M-LYO发生器。（二）过氧化氢“干雾”消毒灭菌技术由于利用闪蒸技术研制的气化过氧化氢灭菌设备需要使用高浓度过氧化氢，腐蚀性较强，且设备价格高昂，其使用范围仅局限于小型耐腐蚀可密闭空间如传递舱、隔离器、冻干机、生物安全柜、医疗器械、生物培养箱和气闸间等的消毒灭菌，并不适合大型空间如GMP洁净车间、医院手术室等的消毒灭菌。随着雾化技术的发展，人们已可以将消毒液雾化为小于10μm的小颗粒即所谓干雾技术。由于这种小颗粒在空气中进行的是无规则运动（布朗运动原理）且不会沉降，也不会聚合在一起产生大的液滴，在与物体表面接触后会反弹，而不会破裂使表面湿润。因此干雾的这些性质使得其扩散性非常好，消毒时不留死角；不湿润表面；不腐蚀设备、彩钢板和墙壁。研究表明，雾化粒子越小，在空气中悬浮时间越来越长，就越有机会与空气中细菌充分接触而达到消毒灭菌的目的。主要代表产品为法国DEVEA公司的Phileas过氧化氢干雾空间灭菌设备以及以及Oxy‘Pharm公司的Nocospray干雾设备。Phileas过氧化氢干雾空间灭菌设备是利用独特设计的快速旋转的阀瓣漫反射液体的原理，将过氧化氢均匀喷雾。液滴可控制在5-10μm。雾化的过氧化氢在整个密闭的空间中进行无规则的布朗运动，粘附于微生物表面，破坏其细胞壁，从而起到完全灭菌效果。该技术的工作原理无需使用任何排气口或压缩空气，由此产生的雾体会迅速发散，在操作的空间内形成灭菌过氧化氢干雾，同时并不会使接触物体表面潮湿。主要设备型号有Phileas100和Phileas500等。6Nocospray干雾设备则是利用文丘里（Venturi）原理研制的一类雾化设备，是利用超高速的风机提供具有高动能的载气（空气），载气的高速流动使经过特殊设计的雾口处出现局部高真空状态，然后过氧化氢液体通过精确计量的注液系统在这个局部真空中自由分散，加上载气提供的强大剪切力，从而分散成接近亚微米的颗粒（5μm左右），在载气的带动下呈螺旋状喷射。主要设备型号为OXY-25000Nocospray干雾设备。利用文丘里（Venturi）原理研制的同类雾化设备还有瑞士的CLEANCube过氧化氢干雾灭菌器和杭州美卓生物生产的DF-25雾化过氧化氢灭菌系统。7这2类设备的优点是①使用的过氧化氢浓度较低，一般是6%左右，腐蚀性较小；②过氧化氢的使用量少，一般是5ml/m3左右。③亚微米过氧化氢颗粒，可快速高效的杀灭细菌、