NCBI基本功能与引物设计

NCBI常用功能与引物设计2010级博士：谢鹏导师：邹晓庭Yoursitehere为何要接触NCBI？如何使用NCBI？如何设计引物？YoursitehereNCBI简介NCBI：NationalCenterforBiotechnologyInformation美国国家信息技术中心（）1992年10月，NCBI承担起对GenBankDNA序列数据库的责任。NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库.Genebank是遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集。GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿个碱基。SubtitleNCBI常用功能查找核酸/氨基酸序列序列相似性分析引物验证Yoursitehere一、查找核酸、氨基酸序列1.以鸡FAT/CD36为例，search：2.调整右侧检索目录，tree--list：Yoursitehere3.浏览信息，下载序列，并以Genebank、FASTA格式保存点击Genebank:氨基酸序列：Genebank核酸序列：……FASTA格式的核酸序列：……Yoursitehere二、序列相似性分析序列相似性分析：就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等序列同源性分析：是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等Blast简介BLAST：“局部相似性基本查询工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的缩写，是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。程序名查询序列数据库搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列Blastx核酸蛋白质核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译后的蛋白质序列逐一比对。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一进行比对。主要的Blast程序：Blast序列相似性分析1.修改测序结果，剔除克隆载体序列在测序结果中找到上下游引物对应位置，剔除引物外的多余部分以鸽子的I-FABP片段为例：GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT……上游引物：5‘-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3’下游引物：5‘-TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3‘TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAYoursitehere2.进入NCBI3.点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项YoursitehereYoursitehere4.寻找相近物种，比较相似性Yoursitehere点击score，获得相似性比较具体信息NCBI官方说明：引物设计与简并PCRRT－PCR原理与技术简介引物设计过程简并PCR技术后续研究YoursitehereRT－PCR原理与技术简介DNAmRNA蛋白质酶活力WesternblotNorthernblot半定量RTPCR定量RTPCRYoursitehereRT－PCR原理与技术简介12Yoursitehere常规引物设计•引物设计原则•Primer5和Oligo6进行引物分析Yoursitehere引物设计原则1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。2.引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大。3.引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。4.ΔG值(自由能)反映引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值）。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带。Yoursitehere以鸡的I-FABP为例，设计常规引物：1.输入I-FABP的已知序列，点击primer:Yoursitehere2.点击search进行引物条件设置：3.Searchcriteria筛选Yoursitehere4.选择最优引物5.手动修改，调整引物YoursitehereBlast引物验证最为重要的环节：对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试1.登陆NCBI——Blast——Primer-BLAST:以文献报道鸡的MUC2的引物为例：YoursitehereYoursitehereYoursitehere简并引物设计Moreofanartthanascience降低简并度（500以下）例如：上游DYNLFDLL下游PVNGNGKQ1.根据密码子表建立引物系列谨慎使用次黄嘌呤SymbolDefinitionBnotADnotCHnotGIInosineKGorT/UMAorCNA,C,GorT/URAorGSCorGVnotT/UWAorTYCorT/U简并引物：在常规引物的某些位点上以简并核苷酸代替。Yoursitehere简并引物设计过程传统方法（适用于保守度高序列）•应用BLAST进行同源序列搜索•应用DNAMAN选择保守区域（氨基酸或核苷酸）•简并引物设计原则•Primer5和Oligo6进行引物分析CODEHOP法（适用于保守度低序列）Yoursitehere应用BLAST进行同源序列搜索a.剪切然后粘贴DNA或蛋白序列；b.使用FASTA格式的序列；FASTA格式的序列以一个单行的说明开始，说明行以其开始处的一个大于号（）与序列数据区分开。说明行以下是序列数据。c.简单使用访问编号：RefSeq或Genebank序号。中文英文缩写密码子甘氨酸GlycineGlyGGGUGGCGGAGGG丙氨酸AlanineAlaAGCUGCCGCAGCG缬氨酸ValineValVGUUGUCGUAGUG亮氨酸LeucineLeuLCUUCUCCUACUGUUAUUG异亮氨酸IsoleucineIleIAUUAUCAUAAUG丝氨酸SerineSerSUCUUCCUCAUCGAGUAGC苏氨酸ThreonineThrTACUACCACAACG赖氨酸LysineLysKAAAAAG精氨酸ArginineArgRCGUCGCCGACGGAGAAGG组氨酸HistidineHisHCAUCAC中文英文缩写密码子天门冬氨酸AspaticacidAspDGAUGAC天门冬酰胺AsparagineAsnNAAUAAC谷氨酸GlutamicacidGluEGAAGAG谷氨酰胺GlutamineGlnQCAACAG脯氨酸ProlineProPCCUCCCCCACCG色氨酸TryptophanTrpWUGG苯丙氨酸PhenylalaninePheFUUUUUC酪氨酸TyrosineTyrYUAUUAC蛋氨酸MethionineMetMAUG胱氨酸CysteineCysCUGUUGCYoursitehereDNAMAN分析序列保守区对Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS进行分析得到保守区序列YoursitehereCODEHOP原理方法：简并PCR技术RNAcDNAcDNA反转录合并产物分装产物β-actin样品PCRYoursitehere简并PCR技术使用标准的反应体系并适当增大引物浓度（1-3µM）退火温度是最关键点：a.采用Touchdown方法优化条件b.采用梯度PCR优化条件c.使用热启动PCR循环数增加至50cycles电泳检测至关重要不用二次扩增重复结果Yoursitehere应用半定量或定量PCR法研究营养物质等对该基因表达水平的影响使用RACE法进行基因cDNA全长扩增进行蛋白质结构预测原核表达系统进化树为RNAi法研究基因功能提供基础后续研究ThankYou!