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LOGO指导教师：XXX食品中微生物的检测班级：XXX学生：XXX学号：XXXLOGOLOGO微生物检验的意义微生物检验是衡量食品和药品卫生质量的重要指标之一，是判定被检食品或药品能否食用或药用的科学依据之一。是判断食品和药品加工原料、生产环境卫生情况及对成品被污染的程度作出正确的评价，为卫生管理工作提供科学依据。微生物检验贯彻“预防为主”的卫生方针，有效的防止或减少食物中、药品毒害、人兽共患病的发生。保障人民身体健康。提高产品质量，避免经济损失。主要内容第一部分菌落总数的测定第二部分霉菌，酵母菌计数第三部分出口食品中大肠菌群，粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法第四部分金黄色葡萄球菌的检验一.菌落总数测定菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数，以CFU/g（mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。一、实验目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。2、掌握平板菌落计数法及熟悉无菌操作技术。3、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。菌落总数测定器材与试剂：检样，无菌蒸馏水，平板计数培养基，1ml吸管，10ml吸管，无菌培养皿（17），镊子，试管（4），均质杯，剪刀，移液枪，报纸，量筒，烧杯，酒精灯，天平电炉、恒温培养箱、恒温水浴箱等。三、流程1、检样2、10倍系列稀释3、5个适宜稀释度各1mL,分别加入无菌平皿内4、平皿内倾注15～20mL琼脂培养基，混匀5、36±1℃培养48±2小时或（24±2）小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7、计算菌落总数→报告四、步骤(一)取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样25g于225ml无菌水一起进入无菌均质杯内8000~10000r/min均质1~2min，制成1：10的均匀稀释液。2、用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1：100的稀释液3、另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。5、稀释液移入平皿后，将冷却至46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h（二）菌落计数做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。1、平皿菌落数的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。（3）当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。（三）结果与报告1、菌落总数的计算方法（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl―第一个适宜稀释度平板数；n2―第二个适宜稀释度平板数；d―稀释因子（第一稀释度）。（3）、若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（4）若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。（5）、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。（6）、若所有稀释度均不在30～300之间，有的300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。2、菌落总数的报告（1）、菌落数在1～100时，按四舍五入报告两位有效数字。（2）、菌落数≥100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。（3）、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。（5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。六、注意事项1、无菌操作操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2、采样的代表性如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。3、稀释液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。5、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。6、倾注培养基的量规定不一，从12～20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。菌落总数测定几点说明由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）报告。菌落总数测定几点要求每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃放置，以便在计数检样时用作对照。原液10-110-210-310-410-51多不可计连片生长185030278000366001实验结果实验结果图片展示10-110-210-310-42.数据处理)/(44025100336678185gCFUg样品原液以及五个稀释度中原液、10-1菌落数目过多，10-3、10-4、10-5菌落数目过少，只有10-2为最适的稀释度。10-2稀释液的菌落数=所以每克柿饼样品中含菌数约为440CFU/g霉菌酵母菌计数霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。霉菌酵母菌菌落形态霉菌菌落形态：菌落呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状。成熟的霉菌菌落多数有各种颜色的孢子形成，随种而异。酵母菌菌落形态：在孟加拉红琼脂平板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色。少数表面粗糙或皱褶，有的菌落周边呈细分枝状。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落，用水制片，置高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大数倍，多为圆形或卵圆形，绝大多数为出芽繁殖。当平板内酵母菌菌落甚多时，常有酒香气孟加拉红（虎红）培养基培养出的霉菌实验流程稀释：1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。培养：倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。计数：选取菌落数10～150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定1.实验数据记录如下项目序号稀释度及菌落数10-110-210-310-410-5霉菌计数11822002541203230000平均数152110酵母菌计数11453202112011371100平均数113110实验结果图片展示•10-110-2•。10-310-410-52.结果处理在10-1~10-5这五个稀释度中，10-1的生长状况较其它稀释度好，所以选取10-1进行计数.每克含霉菌菌落数=（25*10）/25=6(CFU/g)每克含酵母菌菌落数=（11*10)/25=5(CFU/g)（三）、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。大肠杆菌的生物学特性基本形态：此菌为两端钝圆的短