高分辨率和精确质量：复杂基质中食品和饲料分析的完美结合

ApplicationNote:CM30163_C关键词•Exactive•食品分析•杀虫剂杀虫剂筛选•高分辨率质谱高分辨率和精确质量：复杂基质中食品和饲料分析的完美结合MarkusKellmann,AndreasWieghaus,HelmutMuenster,ThermoFisherScientific,Bremen,GermanyLesterTaylor,DipankarGhosh,ThermoFisherScientific,SanJose,CA,USA摘要目的利用新型的ThermoScientificOrbitrap质谱仪检测器，对复杂基质中杀虫剂成份的准确筛选，以显示高分辨（40，000）分析的优势。方法超高压液相色谱系统（U-HPLC）和OrbitrapTM检测器质谱仪（ThermoScientificExactive）联用，在高分辨模式操作。结果高分辨率（15,000-50,000）结合精确质量在检测杀虫剂杀虫剂和毒枝菌素是必须的。引言对杀虫剂，毒枝菌素，兽药的筛选在环境监管，例如食品和动物饲料分析中有着至关重要的作用。这方面的实验传统上运用三重四极杆质谱仪进行，但有以下局限性：·获取数据后不能重新审核·每次分析的化合物数量有限·不能筛选非目标化合物由于以上局限性，现在倾向于使用全扫描质谱进行残留物分析实验，筛检手段多使运用高效飞行时间质谱仪（TOF），质量准确率＜5ppm，分辨率约为15,000，并与超高压效液相色谱系统（U-HPLC）联用。在复杂样品中，例如食品，饲料，毛发，蜂蜜，受到背景基质的影响，这样有限的分辨率会导致质量测量的不精确。本文将展示一种全扫描筛检方法，以全新的单级Orbitrap质谱仪联用U-HPLC，分辨率将高达100,000，能提供准确的质量数。此外，本文就高分辨率条件下的分析优势，将进行两方面的讨论：·解析分辨共洗脱的同分异质目标化合物·精确的元素组成分析方法新型非杂交复合型单级Orbitrap质谱仪（ExactiveTM,ThermoFisherScientific，不来梅，德国）联用U-HPLC色谱（ThermoScientificAccelaTM,ThermoFisherScientific，圣何塞，美国），分析不同浓度条件下包含116种杀虫剂，毒枝菌素和植物毒素的复杂混合物。使用50x2mm反相C18柱（ThermoScientificHypersilGOLDTM,1.9µm粒径,ThermoFisherScientific，麦迪逊，美国），以水/乙腈作为流动相，进行12分钟的梯度洗脱，并用标准溶液和动物饲料提取液，分别对方法的灵敏度、选择性以及线性范围进行了考察评价。为与TOF仪器获得的数据进行比较以及显示超高分辨率的优势，分别在不同分辨率(R=15,000和R=50,000)下进行质量数的测定。Orbitrap检测时运用自动控制进入检测器的离子数完成（AGC,目标值=106）。图1：新型Orbitrap台式质谱仪示意图，包括可产生全离子碎裂的HCD高能碰撞池结果同分异质杀虫剂的分辨率当同分异质化合物被共同洗脱时，如果质谱的分辨能力不足以区分这些化合物，将导致质量不精确和元素组构成错误。图2中，两种杀虫剂噻虫嗪（C8H10CLN5O3S）和对硫磷（C10H14NO5P5）在质子化成为分子离子（MH+）后，质量数分别为292.02656和292.04031。要完全区分这两个质子化的分子离子，需要40,000或者更高的分辨率。特别是从高浓度物质中区分低浓度物质，高分辨率是必需的。图2中两种杀虫剂的浓度比约为1:3，虚线为实际实验曲线，实线为模拟曲线。对元素组构成分析的影响在15,000的分辨率条件下，主要有两方面的局限性：首先，检测不能分辨的两物质会导致严重的质量误差，这将落在不能满足Exactive仪器特有的精度指标之外要求。因而，测定元素组成的质量范围将会扩大，使得符合该元素组成的可能未知物或目标物数目变得非常多。如图3例子所示，抗蚜威的质荷比为239.1503，由于存在同分异质位素峰的干扰，239峰值的质量数误差为6.5ppm。在15,000的分辨率下，上述干扰将得到明显偏大的质量数，而在80,000的分辨率下，两种同位素峰将被完全区分，而质量准确度也将完全达到仪器要求。图2：两种同分异质杀虫剂在分辨率为15,000（上图）和50,000（下图）条件下的质谱图，实线部分为不同分辨率条件下的模拟曲线图3：提高分辨率就可以区分两个靠近的质谱峰以提高质量精度，在分辨率为15,000条件下得到的峰在80,000分辨率下被一分为二为了减少一项分析任务中，备选元素组成的数量，本实验选用了一种高度复杂的计算软件。该软件考虑特定单一同位素峰和其同位素的峰的峰高和质量精度，为实现功能，所有同位素峰的准确质量都必需在特定范围内，因此只有高分辨率才能排除干扰峰的影响（如图4）。图4分别为杀真菌剂嘧菌酯在分辨率为50,000和80,000下的质谱图。如图所示，中等分辨率在单一同位素峰上表现出很好的质量精度，而在A+1，A+2的分子离子峰上出现了很大的质量误差。这是因为质荷比为405.1452处的同位素峰在中等分辨率下未能被完全分离所引起的干扰。而在高分辨率条件下，三处同位素峰的测定都表现出很高的质量精度。由此可见，根据分辨率为15,000时的实验数据推断元素组成，将很可能出现很大误差甚至是错误结果，只有高分辨率才能测量整个分子离子束的真实质量，进而确定准确的元素组成和化学结构。对于质谱技术来说，分析高复杂样品，例如食品和动物饲料的提取物，筛选监控物质，包括杀虫剂，毒枝菌素和兽药是主要的挑战。一方面，为了在高浓度的基质离子中检测低浓度物质，需要一个很大的内部动态扫描范围；而另一方面，实验又需要高选择性与高灵敏度以避免假阳性，甚至更糟糕的假阴性结果。本文以包含116种杀虫剂与毒枝菌素的马饲料复杂基质为例进行分析，每种物质采稀释到2～250ppb含量，在两种不同分辨率的条件下进行重复实验，为检测这种方法最多可检测的物质种类，我们进行了50,000分辨率条件下100ppb相同混合物的样品分析。图4：分辨率对区分分子离子及其同位素峰的重要性，高分辨率条件下可正确检测完整的分子离子束LC-MS分析检查到提萃取的添加116种杀虫剂基质中的95种杀虫剂。图5为3ppm的质量窗口中，116种物质（基质中50ppb含量）在不同浓度条件下的离子色谱图。数据表明，高分辨率能检测更多物质（高灵敏度）。图6显示了在15,000和50,000分辨率下提取的含量为50ppb的Sulcotrion离子谱图。高分辨率的图谱中显示出两个峰，其中较小的一个是Sulcotrion。低分辨率则完全掩盖了杀虫剂信号，唯一能表明Sulcotrion存在的标志是一个稍宽的峰或者说是峰肩和干扰离子向高质偏移。因此如果只在分辨率15,000进行分析。将导致假阴性结果。这也是造成在15,000分辨率条件下，所检测到的组分数目相对于更高分辨率下检测到的组分数目的减少不成比例的主要原因（图5）。图5：3ppm质量窗口中116种杀虫剂和毒枝菌素(100ppb)叠加提取离子色谱图。插图显示了在两种分辨率下，基质中不同浓度条件下所检测到的化合物数量图6：杀虫剂混合物在两种分辨率条件下（上图为15,000，下图为50,000）的质谱放大图。在15,000分辨率下，Sulcotrion（质荷比为328.02475）的离子峰被完全掩盖，而在50,000分辨率下则能被轻易检测（插入色谱图同样说明两种分辨率的区别）因此，必需在高分辨率条件下进行一系列浓度的测定，图7直到2ppb（2ng/ml），依然表现出处完美的线性关系和灵敏度。结论•相比于TOF仪器，这种新型的台式Orbitrap质谱仪具备超高的分辨率•高达100,000的分辨率为复杂样品分析提供了精确的质量精度•在复杂基质的多残留物筛选中，高分辨率提供了完美的灵敏度，线性以及选择性•高扫描速度（10Hz）完全适用于现代快速的U-HPLC色谱技术对于复杂样品的分析，选择恰当的扫描速度和分辨率能有效的从基质中区分同分异质化合物待分析样品，在低浓度条件下依然能得到准确的测定结果。致谢感谢荷兰RIKILT学院食品安全系的PaulZomer和HansMol提供的实验样品。图7：Metabenthiazuron的定量曲线（2-250ppb），不同浓度条件下定量色谱峰表明即使在低浓度条件下依然可以获得高质量的数据Page4of8Page3of8