病毒病的常规实验室诊断

病毒病的常规实验室诊断蓝胜芝2014.10病毒的分离和鉴（滴）定病毒的分离和鉴（滴）定分离或鉴定前的保存①如果运送或保存不超过4天，则标本应置于中性溶液中，于4℃保存，不要冷冻，因为一次冻融远比短期保存于上述条件下引起的病毒感染滴度下降多得多，-10℃～-20℃的冷冻会使大多数病毒的感染性严重下降；②如长期保存，可冻存于-30℃或更低的温度，-30℃低温保存的病毒材料（除少数例外），至少可以存活几个月以上，而-70℃低温保存的病毒，甚至几年不见毒力降低；欲做病毒分离的材料，无论是上代病毒培养物，还是采自发病或死亡动物的病料，都应尽快送往实验室作病毒分离或鉴定，病毒材料的准备脑、肝、肌肉等器官或组织鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物咽喉拭子粪便无菌的体液或鸡胚液取一小块，剪碎、研磨，加入含青链霉素的HankS液，进行反复冻融，离心取上清含高浓度青链霉素的HankS液稀释3～5倍，4℃作用2-4小时或过夜，离心取上清含青链霉素的HankS液充分清洗棉拭子，反复冻融3～5次，离心取上清含高浓度青链霉素的HankS液10～20倍稀释粪便，4℃作用4小时或过夜，离心取上清可直接使用病毒的接种方法鸡胚病毒种类接种途径病变特征备注卵黄囊绒毛尿囊膜尿囊腔养膜腔脑内狂犬病病毒+++++++鸡胚死亡流感病毒++++++++鸡胚死亡新城疫病毒++++++++鸡胚死亡出现血凝素痘病毒+++痘斑同上蓝舍病病毒++++++++白斑或鸡胚死亡静脉内更敏感传支+++++法氏囊++++++肿瘤性痘斑鹅细小++++胚胎死亡病毒的接种方法组织培养细胞加入不同稀释度的病毒液或待检病料悬液，吸附加入维持液培养（维持液中不含有相应病毒抗体）病毒在组织培养细胞内引起的变化及其判定中和试验病毒间的干扰现象细胞代谢的测定抗原的测定细胞病变（CPE）电子显微镜观察病毒感染力的测定—半数细胞培养物感染量（TCID50)公式：（高于50%的百分数-50）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）+高于50%病变的病毒稀释度上细胞病变孔：50%以上细胞发生病变才可算为细胞病变孔。Reed-Muench内插法Karber法病毒理化学特性的测定①乙醚敏感性试验②氯仿敏感性试验③去氧胆酸钠敏感性试验胰蛋白酶敏感试验①乙醚敏感性试验②氯仿敏感性试验③去氧胆酸钠敏感性试验胰蛋白酶敏感试验耐热性试验病毒粒子大小测定①电子显微镜直接测量②滤过试验③超速离心沉底目的目的在由临床病料分离获得毒株后，应用已知的抗病毒血清或单克隆抗体进行免疫-血清学试验，鉴定病毒的种类乃至型别由发病动物采集血清标本，用全病毒或特异性病毒抗原，测定发病动物体液中的特异性抗体，或进一步比较发病动物急性发病期和恢复期血清中的抗体效价，了解病毒性抗体是否有明显的增长，从而判定病毒感染的存在中和试验中和抗体：动物在受到病毒感染后，体内产生的能与相应病毒粒子特异性结合，使后者丧失感染力的抗体。中和抗体一般是针对病毒的蛋白衣壳或囊膜抗原的，并针对病毒粒子的内部成分。中和试验(NeutralizationTest)①终点法中和试验固定病毒稀释血清法（β）：固定血清稀释病毒法（α）中和试验固定病毒稀释血清法病毒滴定（200TCID50）血清与病毒的感作对照接种血清56℃，30min，2倍或10倍系列稀释观察和解释接种:小鼠脑内-0.03ml1日龄哺乳幼鼠腹腔-0.03ml9~12日龄鸡胚绒毛尿囊腔-0.1~0.2ml1ml营养液的组织培养细胞管-0.2ml96孔细胞培养板每孔-0.01ml~0.02ml24孔细胞培养板每孔-0.02ml~0.05ml6孔细胞培养板每孔-0.5ml中和试验固定血清稀释病毒法已知效价的抗血清（通常为阴性对照）测定未知效价的抗血清结果以中和指数表示试验组LD50(EID50、TCID50)中和指数=──────────────────对照组LD50(EID50、TCID50)中和试验(NeutralizationTest)②蚀斑减数试验（PlaqueReductionNeutralizationTest，PRNT）蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。中和试验(NeutralizationTest)③交叉保护试验应用已知病毒鉴定未知病毒应用已知免疫血清鉴定未知病毒应用已知病毒鉴定未知血清④动态中和试验测定病毒与特异性抗血清反应中，不同作用时间时病毒存活率的一中中和试验方法。试验：血凝素与RBC表面相应受体结合,引起RBC凝集，用以测定病毒的含量。用途：①确定病毒的含量；②计算病毒的血凝价，为血凝抑制试验做准备血凝价：能使血球产生50%凝集的病毒最高稀释度血凝单位：以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝聚效价，即一个血凝单位。：抗体与血凝素结合，封闭血凝素，使之不能与红细胞结合用途:①用于检测血清中抗体含量；②鉴定病毒的型、亚型；血凝抑制价：能完全抑制血球凝集的最高血清稀释度即为该血清的血凝抑制价试验血凝和血凝抑制不需要应用活的试验宿主系统，而且可在几十分钟到几小时内获得结果，操作有较简便，因此是诊断和鉴定某些病毒，如正粘病毒、富粘病毒、披膜病毒和细小病毒等的常用方法。红细胞吸附和吸附抑制试验原理：红细胞吸附现象是感染细胞表面存在病毒蛋白的结果，病毒感染细胞后开始合成病毒成分时，就可吸附红细胞，而血凝现象则是成熟的病毒粒子逸出于营养液后，才使营养液具有血凝能力。因此红细胞吸附现象一般早于血凝现象。由于红细胞现象也可被特异性抗血清所抑制，故在病毒鉴定，特别是对某些不产生细胞病变的病毒，常用红细胞吸附和吸附抑制试验进行快速鉴定。补体结合试验（CFT）原理：CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特异性结合的一类实验。参与本实验的五种成分分为两个系统①待检系统：已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）②指示系统：SRBC和SRBC相应溶血素补体结合试验（CFT）（Ag+Ab）+补体双方不相对应（或缺少一方）形不成IC不能激活并固定补体加入SRBC和溶血素出现溶血双方相对应形成IC激活并固定补体加入SRBC和溶血素不出现溶血凝集试验颗粒性抗原与相应抗体，或表面包被抗原（抗体）的颗粒状物质与相应的抗体（抗原）在电解质存在的条件下相互结合，出现肉眼可见的凝集团现象。1.红细胞2.聚苯乙烯胶乳颗粒载体颗粒：凝集试验反向间接凝集反应:将抗体致敏的红细胞与样本中相应抗原作血凝试验观察红细胞凝集现象，用以判断样本中相应抗原的有无及其效价。免疫粘附血凝试验（IAHA）根据抗原－抗体复合物在C3存在时能粘附到灵长类红细胞或非灵长类血小板上的现象检查抗原或抗体的方法。这一方法是20世纪60年代发展起来的，具有高度敏感性。其原理是：抗原-抗体-补体(C142)的复合物可以吸附数百个C3分子，而活化后的每个C3分子又可与有C3受体的指示细胞（如人的O型红细胞）发生粘附作用,所以只要试验系统中存在极少量的抗原-抗体复合物，就可通过与补体系统作用使红细胞凝集。此方法操作简便、不用溶血素、不需滴定补体，可用于检测病人血清中有无乙型肝炎表面抗原。琼脂扩散试验双向琼脂扩散：可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线.琼脂扩散试验将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。•是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。•应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的水平。单向琼脂扩散对流免疫电泳在电场作用下进行的双向凝胶扩散：在通电的琼脂中，抗原和抗体向相反的电极移动,当它们在最适宜的比例处相遇时,可形成白色的沉淀线。实际上，这是一种加速的双向琼脂扩散试验。试验所需时间短、敏感性高，但特异性比较差。一般用于各类蛋白的定性分析和半定量测定。单扩溶血试验是在琼脂单扩散基础上发展起来的，又称为被动溶血技术，主要用于流感病毒血凝素和神经氨酸酶抗体的测定。吸附在红细胞表面上的抗原与同种抗体结合，再加上补体的作用，就会使红细胞溶血，由于糠油抗体血清的稀释度与溶血圈直径或面积的大小成直线关系，所以可对血清抗体进行定量测定。免疫荧光技术荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光抗体技术荧光抗原技术直接间接补体免疫荧光技术直接法：荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。直接荧光抗体染色法示意图免疫荧光技术间接法：特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图免疫荧光技术补体法：用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体抗补体抗体染色法示意图